Achieving Improved Sensitivity and Reliable Analytical Performances in Nucleotides Analysis

Význam tématu

Analýza nukleotidů představuje základní prvek v oblasti biochemického a farmaceutického výzkumu. Při kvantitativním měření sloučenin obsahujících fosfátové skupiny často dochází k adsorpci na kovové povrchy kapilár a kolonek, což vede k deformovaným tvarům píků, snížené citlivosti a nižší reprodukovatelnosti výsledků. Zavedení metal-free průtokové cesty a bezkovových kolon v UHPLC systémech umožňuje překonat tyto omezení a zajistit spolehlivou analýzu fosfátových analytů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované studie je porovnat klasickou kovovou UHPLC konfiguraci se systémem Nexera XS inert využívajícím bezkovovou průtokovou cestu a bezkovovou C18 kolonku. Studie hodnotí vliv kovové adsorpce na kvalitu píků, stabilitu plochy píků, linearitu kalibračních křivek a přesnost kvantifikace standardních roztoků AMP, ADP a ATP.

Použitá metodika a instrumentace

Pro srovnání byly použity dvě konfigurace:

• Metal-based: UHPLC Nexera XS s kovovou průtokovou cestou a C18 kolonkou Shim-pack Scepter C18-120
• Metal-free: UHPLC Nexera XS inert s bezkovovou průtokovou cestou a bezkovovou kolonkou Shim-pack Scepter C18-120

Analytické podmínky:

• Mobilní fáze: acetonitril / 10 mmol·L⁻¹ formiát amonný (0,5 : 99,5 v/v)
• Průtok: 0,2 mL·min⁻¹
• Teplota kolony: 40 °C
• Objem injekce: 2 µL
• Detekce: UV při 254 nm pomocí inertní detekční cely

Hlavní výsledky a diskuse

V kovové konfiguraci se pozorovalo výrazné vytěžování píků a nárůst asymetrie s každou další injekcí, což potvrdily rostoucí hodnoty asymetrického faktoru a kolísání plochy píků ATP. Naopak v bezkovové konfiguraci byly píky ostré a symetrické (faktor ~1,0) a plocha píků stabilní po deseti analýzách. Kalibrační křivka ATP vykazovala u kovové sestavy nižší linearitu (r2=0,9918) s nemožností detekce 1 µg·mL⁻¹, zatímco bezková sestava dosáhla r2=0,9999 a přesné měření od 1 µg·mL⁻¹. Precision a accuracy v intra-sérii pro QC vzorky byly v bezkové konfiguraci lepší než ±1 % a blízko 100 %, zatímco kovový systém vykazoval odchylky až přes 100 %.

Přínosy a praktické využití metody

Systém Nexera XS inert s bezkovovou kolonkou výrazně zvyšuje citlivost a reprodukovatelnost analýzy nukleotidů bez nutnosti předchozí kondicionace či přidávání chelatačních činidel. Metoda je vhodná pro rutinní kvantitativní analýzu biologických vzorků a pro monitorování fosfátových metabolitů v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozšíření využití bezkovových UHPLC systémů lze předpokládat v oblasti analýzy jiných fosfátových biomolekul, nukleosidových analogů a posttranslačních modifikací proteinů. Integrace do multikomponentních metod omické analýzy a online hyphenovaných technik nabídne nový rozměr v kvalitativním i kvantitativním výzkumu.

Závěr

Bezková průtoková cesta s inertní UHPLC platformou významně potlačuje adsorpci fosfátových sloučenin na kovových površích, což vede k ostrým píkům, stabilní plochě píků, vynikající linearitě kalibrace a vysoké přesnosti kvantifikace. Kombinace Nexera XS inert a bezkovových Shim-pack Scepter C18 kolonek představuje spolehlivé a robustní řešení pro analýzu nukleotidů.

Reference

D. Fujimura, E. Ando, R. Suzuki: Achieving Improved Sensitivity and Reliable Analytical Performances in Nucleotides Analysis. Shimadzu Corporation, First Edition Feb. 2022.