Solutions for Aggregate and Fragment Analyses - SEC COLUMN TECHNOLOGY

Význam tématu

Size-exclusion chromatography (SEC) je klíčová technika pro charakterizaci agregátů a fragmentů biologických léčiv a virových vektorů. Umožňuje rychlé stanovení velikostního distribuce proteinů, zajišťuje kvalitu a konzistenci vyráběných preparátů a podporuje rozhodování v průběhu vývoje a výroby bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Popisovat technologii kolonek SEC dostupných ve formátech UPLC a HPLC, uvádět doporučení výběru podle molekulové hmotnosti vzorku, systémové disperze a požadovaného rozlišení. Studie rovněž předkládá výsledky testů stability a reprodukovatelnosti v modelových podmínkách.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byla použita následující instrumentace:

• ACQUITY UPLC H-Class Bio System s disperzí systému <20 µL
• ACQUITY Premier Protein SEC kolony (125 Å, 200/250 Å, 450 Å; 1,7 µm) pro UPLC
• XBridge Premier Protein SEC a XBridge Protein BEH kolony (125 Å, 200 Å, 450 Å; 2,5 µm) pro HPLC
• Mobilní fáze: 2× PBS (20 mM fosfát, 276 mM NaCl, 5,4 mM KCl, pH 7,4)
• Parametry provozu: teplota 35 °C, vlnová délka detekce 280 nm, průtok v rozmezí 300–575 µL/min

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy modelové směsi monomeru IgG1 a variant velikostních standardů ukázaly:

• Optimální rozlišení monomeru, vysokomolekulárních (HMWS) i nízkomolekulárních (LMWS) komponent
• Minimální sekundární interakce díky BEH povrchové chemii a optimalizované pórózní struktuře (125–450 Å)
• Konzistentní výkon při různých úrovních systémové disperze a objemech injekce

Diskutována byla také vliv délky kolony (150 vs. 300 mm) na rezoluci při rozdílu hmotnosti komponent menším a větším než dvojnásobek.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje:

• Rychlou a spolehlivou kvantifikaci agregátů a fragmentů proteinů
• Flexibilitu pH >7 pro různé typy vzorků
• Škálovatelnost od objevování produktů až po výrobní procesy
• Opakovatelnost výsledků díky přísné kvalitativní kontrole (QC) použitých standardů

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj stacionárních fází s nižšími nežádoucími interakcemi, širší kompatibilitou s hmotnostní spektrometrií a automatizací provozu. Dále se uplatní multidimenzionální chromatografie kombinující SEC s jinými technikami a vývoj rychlejších kolonek pro vysokopropustné screeningy.

Závěr

Prezentované SEC kolonky poskytují robustní a univerzální řešení pro analýzu velikostní distribuce proteinů. Jasné doporučení volby pórózní velikosti, částic a délky kolony podle typu vzorku umožňuje maximalizovat rezoluci a reprodukovatelnost výsledků.

Reference

• Waters Corporation. SEC Optimization Guide, p/n: 720006067EN.
• Waters Corporation. Application Note: SEC Column Technology, p/n: 720006336EN.
• Waters Corporation. SEC COLUMN TECHNOLOGY Whitepaper, January 2022, p/n: 720006659EN.