HPLC-UV Method for the Fractionation of Basic and Neutral Compounds Extracted from Human Plasma and Urine using SOLA CX

Význam tématu

Oddělení neutrálních a zásaditých sloučenin z biologických vzorků, jako je lidská plazma a moč, je klíčové pro přesnou bioanalýzu v klinických a farmaceutických laboratořích. Efektivní frakcionace zlepšuje selektivitu, odstraňuje interferenty z matice a zvyšuje citlivost detekce analytů, což je zásadní pro spolehlivé kvantitativní stanovení farmak nebo endogenních molekul.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem aplikace bylo demonstrovat využití cartridge SOLA CX pro selektivní extrakci neutrálních a zásaditých látek z lidské plazmy a moči a následnou analýzu pomocí HPLC-UV s kolonou Accucore RP-MS. Studie ukazuje, jak lze díky frakcionaci minimalizovat vzájemné potlačení analytů a dosáhnout vysoké přesnosti a reprodukovatelnosti výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci byl použit pevný fázový sorbent SOLA CX (10 mg, 1 mL) s následujícími kroky:

• Kondicionování: 1 mL methanolu, 1 mL vody
• Aplikace vzorku: 350 µL natrikově obohacené plazmy nebo moči
• Oplach: 350 µL vody s 2 % kyselinou mravenčí
• Eluce: nejprve 350 µL methanolu, poté 350 µL methanolu s 5 % amoniaku
• Přidání interního standardu: 50 µL progesteronu + 350 µL vody

Chromatografická separace probíhala na systému Thermo Scientific HPLC s kolonou Accucore RP-MS (2,6 µm, 50×3 mm). Mobilní fáze A byla 20 mM octan amonný, fáze B acetonitril. Gradient začínal na 5 % B, během 5 minut stoupl na 95 % B, udržel se 0,5 minuty a během dalších 2 minut se vrátil na 5 % B. Průtok byl 0,8 mL/min, teplota kolony 25 °C, detekce UV při 254 nm, injekční objem 10 µL.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukázala, že běžné chromatografické podmínky nedokážou dostatečně oddělit hydrokortison a propranolol, které koelují přibližně při 3,75 min. Frakcionace pomocí SOLA CX umožnila tyto analytické skupiny rozdělit do neutrální a zásadité frakce. Výsledky extrakce z plazmy a moči prokázaly vysoké procento recovery (87–102 %) a nízkou variabilitu (RSD do 12 %), což potvrzuje spolehlivost a robustnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší:

• Vysokou čistotu extraktů a snížení matričních interferencí
• Nižší spotřebu organických rozpouštědel
• Zvýšení reprodukovatelnosti a přesnosti kvantifikace
• Možnost vysokopropustného zpracování vzorků v klinických a bioanalytických laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

V budoucnu lze metodu rozšířit o:

• Automatizaci SPE procesu pro vyšší propustnost
• Integraci s hmotnostní spektrometrií pro zvýšení citlivosti
• Adaptaci na další složité biologické matice (tkáňové extrakty, cerebrospinální mok)
• Miniaturizaci cartridge a spotřeby rozpouštědel pro zelenou analytiku

Závěr

Studie potvrdila, že použití SOLA CX cartridge ve spojení s kolony Accucore RP-MS poskytuje robustní, citlivý a vysoce reprodukovatelný postup pro frakcionaci a kvantifikaci neutrálních a zásaditých sloučenin v lidské plazmě a moči.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific HPLC systém
• Accucore RP-MS 2,6 µm, 50×3 mm kolona
• SOLA CX 10 mg / 1 mL cartridge