Impurity analysis of L-aspartic acid and glycine by HPLC-UV-CAD

Význam tématu

Aminokyseliny jsou klíčovými stavebními kameny proteinů, výživových doplňků i farmaceutik. Kontrola jejich čistoty je nezbytná z důvodu bezpečnosti a účinnosti přípravků. Tradiční metody v evropském farmakopoeálním standardu spoléhají na derivatizaci ninhydrinem pro aminokyseliny a samostatné UV metody pro organické kyseliny, což je časově náročné a méně citlivé pro slabo-chromoforické látky.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo navrhnout robustní, rychlou a vysoce citlivou HPLC metodu s hyphenovanou detekcí UV a Charged Aerosol Detector (CAD) pro simultánní kvantifikaci L-asparagové kyseliny (Asp) a glycinu (Gly) včetně jejich možných nežádoucích organických a aminokyselinových nečistot v jediném chromatografickém běhu. Metoda je porovnána s kompendiálními postupy a validována dle ICH Q2(R1).

Použitá instrumentace

• HPLC systém Thermo Scientific Vanquish Horizon (Pump H, Split Sampler HT, Column Compartment H)
• Kolonka C18 Thermo Scientific Acclaim Polar Advantage II, 150 × 4.6 mm, 3 μm
• Detektory: Vanquish Charged Aerosol Detector H a Vanquish Variable Wavelength Detector F (210 nm)
• Chromeleon Chromatography Data System verze 7.2.6
• Reagencie: perfluoropentanoová kyselina (NFPA), trifluoroctová kyselina (TFA), perfluorheptanoová kyselina (TDFHA), acetonitril, voda (18.2 MΩ·cm)

Hlavní výsledky a diskuse

Pro Asp byla vyvinuta izokratická metoda s 7 mM NFPA a 4 mM TFA ve vodě; pro Gly gradientní metoda s 1,25 mM TDFHA/TFA ve vodě a 1,25 mM TDFHA v acetonitrilu. Optimalizace teploty odpařování CAD (50 °C pro Asp, 70 °C pro Gly) a filtrační konstanty zlepšila poměr signál/šum. Metody prokázaly lineární odezvu (R2 > 0,997), LOQ 5–50 ng on-column, recovery 92–111 % a robustní opakovatelnost (<4 % RSD). Analýza čtyř komerčních šarží ukázala úspěšné zjištění všech deklarovaných nečistot ve srovnání s Ph. Eur. postupy a významné zkrácení doby analýzy (Asp: 10 min vs. 110 min, Gly: 35 min vs. 57 min).

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace časově náročné derivatizace ninhydrinem
• Simultánní detekce aminokyselin a organických kyselin v jediném běhu
• Zvýšená citlivost pro slabo-chromoforické aminokyseliny
• Snížení doby analýzy až o 90 % (Asp) a 65 % (Gly)
• Kompatibilita s farmaceutickou kontrolou kvality (Ph. Eur.)

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření hyphenovaných detekčních systémů (UV-CAD a MS) pro kontrolu nečistot v dalších polarických sloučeninách a biopolymerech. Dále se otevírají možnosti využití nových ion-párovacích činidel, miniaturizace chromatografických systémů a plně automatizované workflow pro online QC procesy v průmyslové výrobě.

Závěr

Navržené HPLC-UV-CAD metody pro L-asparagovou kyselinu a glycin poskytují rychlý, citlivý a robustní nástroj pro komplexní impurity profiling. Metody splňují farmakopoeální požadavky, šetří čas i náklady a mohou nahradit dosavadní derivatizační a oddělené UV postupy v rutině QC laboratoří.

Reference

1. Council of Europe, European Pharmacopoeia Online 10.2, Chapter 2.2.56, 2020.
2. Council of Europe, Ph. Eur. Monograph no. 0797 (L-asparagová kyselina), 2020.
3. Council of Europe, Ph. Eur. Monograph no. 0614 (Glycin), 2020.
4. Petritis K., Chaimbault P., Elfakir C., Dreux M., J. Chromatogr. A, 1999, 833, 147–155.
5. Crafts C., Plante M., Bailey B., Acworth I., Thermo Fisher Scientific Application Note 70038, 2012.
6. Pawellek R., Schilling K., Holzgrabe U., J. Pharm. Biomed. Anal., 2020, 183, 113–149.
7. Holzgrabe U., Nap C.-J., Almeling S., J. Chromatogr. A, 2010, 1217, 294–301.
8. Schilling K., Pawellek R., Lovejoy K., Muellner T., Holzgrabe U., J. Chromatogr. A, 2018, 1576, 58–66.
9. ICH Q2(R1), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, 2005.
10. ICH Q3A(R2), Impurities in New Drug Products, 2006.