Lifetime stability of size exclusion chromatography columns for protein aggregate analysis

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) patří mezi nejdůležitější třídu biologických léčiv díky své vysoké specifitě k cílům v organismu a dlouhé poločasu v krevním řečišti. Během výroby, formulace a skladování může dojít k tvorbě agregátů, které snižují účinnost léčiva a mohou vyvolat nechtěné imunitní reakce. Pravidelný a spolehlivý monitoring agregací je proto klíčovým kritickým kvalitativním atributem (CQA) v biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo demonstrovat dlouhodobou stabilitu analytických SEC kolon Thermo Scientific MAbPac SEC-1 v dimenzích 4 × 300 mm a 7,8 × 300 mm při analýze agregátů monoklonální protilátky bevacizumabu. Analýzy probíhaly na systému Thermo Scientific Vanquish Flex Quaternary UHPLC, přičemž byla sledována opakovatelnost retenčních časů, tvar a asymetrie píků a udržení účinnosti kolony ve stovkách až tisících injekcí.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu mobilních fází byly použity roztoky fosforečnanů s 300 mM NaCl, filtrované přes 0,2 µm membránu. Pro kolonu 4,0 × 300 mm byla aplikována koncentrace 100 mM fosfátu, pro kolonu 7,8 × 300 mm 50 mM fosfátu (pH 6,8). Systém Vanquish Flex zahrnoval:

• Quaternary Pump (VF-P20-A)
• Split Sampler FT se smyčkou 25 µL
• Column Compartment H (VH-C10-A)
• Diode Array Detector HL s LightPipe 10 mm (6083.0100)

Analýzy probíhaly při 30 °C s rychlostmi 0,25 mL/min (4 mm kolona) a 0,8 mL/min (7,8 mm kolona). Vzorek bevacizumabu 2,5 µg/µL byl injikován v objemech 2 µL respektive 0,5 µL. Data se sbírala a vyhodnocovala v Chromeleon 7.2 SR4.

Hlavní výsledky a diskuse

Při více než 1950 injekcích na 4,0 × 300 mm koloně byla zjištěna rozdílnost retenčního času monomeru pouze o 0,043 min a asymetrie v rozsahu 0,88–0,93. Po 1953 injekcích byla zachována více než 85 % původní účinnosti (teoretické destičky EP). U standardní 7,8 × 300 mm kolony bylo dosaženo stabilní separace až do 1292 injekcí, přičemž účinnost zůstala nad 55 % původní hodnoty. Pokles účinnosti u 7,8 mm kolony mezi 300 a 500 injekcemi byl identifikován jako vliv stárnutí vzorku, nikoli degradace kolony; po obnově vzorku se účinnost vrátila.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou robustnost a reprodukovatelnost separace agregátů mAb
• Minimální sekundární interakce díky speciální diolové modifikaci stacionární fáze
• Výrazné prodloužení životnosti kolony (tisíce injekcí bez ztráty výkonu)
• Snížení spotřeby vzorku a mobilních fází díky úzké koloně a nízkým průtokům
• Možnost nepřetržitého provozu UHPLC s vysoce solnými nebo mírně korozivními mobilemi fázemi

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj miniaturizovaných SEC kol a přechod na úplně integrované systémy online QC pro biologické prefabrikáty. Hyphenace SEC s hmotnostní spektrometrií zlepší citlivost a přesnost detekce rozptýlených forem proteinu. S nástupem umělé inteligence a strojového učení bude možné automatizovat vyhodnocování agregací a predikovat degradaci v reálném čase.

Závěr

Study potvrdila, že kombinace MAbPac SEC-1 kolony a UHPLC Vanquish Flex nabízí vynikající dlouhodobou stabilitu a reprodukovatelnost separace monoklonálních protilátek. Obě dimenze kolony (4 × 300 mm a 7,8 × 300 mm) vykázaly vysokou životnost a zachování účinnosti, což podporuje jejich zařazení do rutinních QC protokolů v biotechnologickém průmyslu.

Reference

1. Thermo Scientific Application Note AN21602: The importance of correct UHPLC instrument set-up for protein aggregate analysis by size-exclusion chromatography, 2016.