N-Glycan Analysis of Biotherapeutic Glycoproteins Using AdvanceBio Gly-X 2-AB Express Sample Preparation and LC/FLD/MS

Analýza N-glykanů bioterapeutik pomocí Agilent AdvanceBio Gly-X 2-AB Express a LC/FLD/MS

Význam tématu

N-glykanová modifikace bílkovin patří k nejdůležitějším posttranslačním úpravám, které ovlivňují imunitní odpověď, farmakokinetiku a farmakodynamiku bioterapeutických produktů. Spolehlivá a standardizovaná analýza N-glykanů je proto klíčová pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti léčiv na bázi monoklonálních protilátek či Fc-fúzních proteinů.

Cíle a přehled studie

Cílem předloženého průvodce je představit kompletní workflow přípravy vzorků, separace a detekce N-glykanů označených 2-AB (2-aminobenzamid) pomocí platformy Agilent AdvanceBio Gly-X 2-AB Express. Studie demonstruje workflow na modelových proteinech rituximab (Rituxan) a etanercept (Enbrel), včetně standardizace pomocí komerčně dostupných glykanových standardů.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow pro analýzu N-glykanů sestává z následujících kroků:

• Denaturace proteinu: 3 min při 90 °C
• Deglycosylace PNGáza F: 5 min při 50 °C (in-solution)
• Označení 2-AB: 60 min při 80 °C na pevné fázi (no dry down)
• Čištění: 10–15 min vakuově na 96-well destičce, eluace vodou
• UHPLC separace: HILIC kolona AdvanceBio Glycan Mapping (2.1×150 mm, 1.8 μm), teplota 40 °C, gradient akrylonitril/ammonium formiátu, injekce 1 μL
• Detekce: 1260 Infinity II FLD (λEx 285 nm, λEm 345 nm)
• MS analýza: 6545XT Q-TOF v režimu vysokého rozlišení, m/z 600–3000

Použitá instrumentace

• Agilent 1290/1260 Infinity II UHPLC systémy
• AdvanceBio Glycan Mapping kolony (HILIC, 300 Å, 1.8 μm)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF MS s Dual AJS ESI
• MassHunter BioConfirm B.10.00 pro kvalifikativní analýzu
• Termocyklér/dry block heater a vakuový manifold pro přípravu vzorků

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografické profily ukázaly typickou distribuci N-glykanů pro Rituxan i Enbrel, s dominantními formami G0F, G1F a jejich izomery. Relativní plocha hlavních glykanů byla reprodukovatelná (CV ≤10 %). Workflow umožnil kompletní detekci a semikvantitativní vyhodnocení v rámci 2 hodin od zahájení přípravy vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší zkrácení celkového času přípravy vzorku díky reagenciím v roztoku i na pevném nosiči bez nutnosti vysušování, modulární formát kitu umožňuje flexibilní nasazení, a použití osvědčeného 2-AB značení zajišťuje kontinuitu dat v dlouhodobých projektech. K dispozici je řada komerčních glykanových standardů pro kalibraci a identifikaci izomerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Ve vývoji je další automatizace přípravy vzorků, rozšíření glykanových knihoven o modifikované struktury a integrace pokročilých bioinformatických nástrojů pro automatizované vyhodnocení dat. Kombinace s novými MS technikami a vyšším průtokem UHPLC umožní hlubší profilaci glykomu v bioprocessingu i klinických vzorcích.

Závěr

Agilent AdvanceBio Gly-X 2-AB Express workflow nabízí standardizované a rychlé řešení pro analýzu N-glykanů bioterapeutik s vysokou reprodukovatelností a nízkou variabilitou. Celkové zkrácení přípravy a modularita kitu usnadňují implementaci v RG/QC laboratořích i výzkumných prostředích.

Reference

1. N-Glycan Analysis: Better Together. Agilent Brochure 5994-1647EN.
2. Streamlined Workflows for N-Glycan Analysis of Biotherapeutics using Agilent AdvanceBio Gly-X Instant PC and 2-AB Express Sample Preparation with LC/FLD/MS, Application Note 5994-1348EN.
3. Analysis of Labeled Glycans User Manual 5994-1231EN.
4. AdvanceBio Glycan Standards Instant PC, 2-AB, 2-AA, APTS, InstantAB, InstantQ, Unlabeled, Technical Flyer 5994-2202EN.
5. Varki A, et al. Symbol Nomenclature for Graphical Representations of Glycans. Glycobiology. 2015 Dec;25(12):1323–1324.
6. Development of a Rapid 2-AB Sample Preparation Workflow for N-Glycan Release and Labeling, Application Note 5994-0945EN.
7. Agilent AdvanceBio Gly-X N-Glycan Prep with 2-AB Express Kit User Manual 5994-1228EN.