LC-MS for detection of SARS-CoV-2 viral and host proteins

Význam tématu

Analýza vzorků z nosohltanu a plazmy u pacientů s COVID-19 pomocí LC-MS poskytuje alternativní či doplňkovou metodu k RT-PCR a antigenním testům. Cílem je jak spolehlivě potvrdit přítomnost viru, tak kvantifikovat změny v hostitelské proteomice, jež mohou sloužit jako prognostické biomarkery pro sledování závažnosti onemocnění.

Cíle a přehled studie / článku

Prvním cílem bylo vyvinout a validovat komplexní workflow založené na vysoce přesné hmotnostní spektrometrii (Orbitrap Fusion Lumos) a selektivním monitorování reakcí (SRM) na TSQ Altis pro detekci virových i hostitelských proteinů v plasmatických a nosohltanových vzorcích. Studie porovnala skupiny pacientů s mírnými a těžkými příznaky, aby odhalila proteiny korelující se závažností onemocnění.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly nejprve zbaveny vysoce abundantních proteinů, dále redukovány, alkylovány a tráveny trypsinem. Vzorky z nosohltanu byly heat-inaktivovány a proteiny precipitačně extrahovány směsí organických rozpouštědel, poté redukovány, alkylovány a tráveny.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (data-dependent acquisition, rozlišení 60 000, HCD)
• TSQ Altis triple quadrupole MS (SRM, rozlišení Q1/Q3 0,7 FWHM)
• Vanquish Flex Quaternary UHPLC (rychlá chromatografie 10 min)
• EASY-nLC 1200 nano-LC (120 min gradient) s Hypersil GOLD a Acclaim 100 C18 kolonymi

Hlavní výsledky a diskuse

Objevová label-free kvantifikace odhalila 1 200 proteinů v plazmě, z nichž 38 vykazovalo významné rozdíly mezi těžkými a mírnými případy. Mezi klíčové proteiny patřily angiotenzinogen (AGT), apolipoprotein B (ApoB), SERPINA3, SERPING1 a fibrinogen gamma chain (FGG), potvrzené SRM analyzami. U nosohltanových vzorků bylo detekováno 11 vysoce reprodukovatelných virových peptidů z nukleoproteinu, spike proteinu a replicase polyproteinu. SRM metody umožnily kvantifikovat i hostitelské proteiny jako LDHA a interleukin-6.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená specifita detekce v kombinaci s kvantitativními informacemi o hostitelských biomarkerech
• Doplňkový test k RT-PCR pro potvrzení falešných výsledků
• Rychlé rutinní SRM analýzy vhodné pro klinické laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace LC-MS diagnostiky do klinického prostředí bude vyžadovat standardizaci protokolů, rozšíření validace na větší kohorty a automatizaci přípravy vzorků. Další rozvoj multiplexních SRM panelů hostitelských biomarkerů by mohl umožnit včasné rozlišení rizikových skupin a sledování léčebné odpovědi.

Závěr

Prezentované workflow kombinuje objevnou a cílenou proteomiku pro komplexní detekci SARS-CoV-2 a monitorování hostitelské proteomu. Ukázalo se, že SRM analýzy na triple kvadrupólu mohou spolehlivě detekovat virové peptidy i prognostické hostitelské proteiny, což rozšiřuje diagnostické i prognostické možnosti v klinickém výzkumu COVID-19.

Reference

1. Tang Y, Schmitz JE, Persing DH, Stratton CW. Laboratory Diagnosis of COVID-19: Current Issues and Challenges. J Clin Microbiol. 2020;58(6):e00512-20.
2. Suvarna K, Pai MGJ, Srivastava S, Bhattacharyya D, Hassell K. COVID-19 plasma deep proteome reveals distinct signatures in severe patients. Preprint 2021.
3. Shen B, et al. Proteomic investigation reveals dominant alterations of neutrophil degranulation and mRNA translation pathways in COVID-19 patients. PLoS One. 2020;15(11):e0240012.