Benchmark of Micro-flow Chromatograph for Robust Proteomics Analysis

Význam tématu

Moderní proteomická analýza vyžaduje platformy, které kombinují vysokou citlivost, reprodukovatelnost a robustnost s dostatečnou propustností. Mikroproudová kapalinová chromatografie (micro-flow LC) představuje kompromis mezi nano-flow a standardní analytickou LC, zatímco nabízí lepší stabilitu a kratší doby analýzy oproti nano-flow přístupům.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat výkon mikroproudového LC-MS systému (Vanquish Neo UHPLC a Orbitrap Exploris) pro různé proteomické aplikace: label-free kvantifikaci HeLa digesu, TMT11plex kvantifikaci kvasinkového digesu a hloubkové profilování PBMC z několika druhů. Experimenty zahrnovaly různé množství vzorku (1–20 µg) a délky gradientu (30 a 50 minut), včetně aktivace FAIMS Pro Duo pro zvýšení hloubky proteomu.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: HeLa Protein Digest Standard, TMT11plex Yeast Digest Standard, PBMC z lidských a zvířecích zdrojů.
• Chromatografie: Vanquish Neo UHPLC, PepMap C18 2 µm kolona 150×1 mm, gradienty 30 a 50 minut.
• Hmotová spektrometrie: Orbitrap Exploris 240 pro label-free, Exploris 480 s FAIMS Pro Duo pro PBMC.
• Datové zpracování: Proteome Discoverer 3.0 s vyhledávacími algoritmy MSPepSearch, Sequest HT a CHIMERYS, 1% FDR, Percolator.

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikace: až 4300 proteinových skupin z 10 µg HeLa digesu s 30min gradientem, mírný pokles při kratších dávkách nebo kratším gradientu.
• Reprodukovatelnost: koeficient variability (CV) pro proteinovou abundanci medianně pod 11 % a více než 80 % proteinů s CV <20 %.
• Label-free kvantifikace: přesnost ratio 1:10 zlepšena delšími gradienty, poměrně nízká komprese signálu.
• TMT kvantifikace: nárůst počtu kvantifikovaných proteinů a peptidů s vyšší náloží a delším gradientem, CV pro knock-out kanály pod 10 %.
• PBMC profilování: s FAIMS Pro Duo přes 3000 proteinů z různých druhů, excelentní reprodukovatelnost přes 100 injekcí.
• Datová kvalita: více než 99 % spekter bez zmeškaného štěpení, alkylace nad 96 %, metioninová oxidace ~3,6 %, deaminace ~5,5 %.

Přínosy a praktické využití metody

Micro-flow LC-MS nabízí stabilní výkon napříč dlouhými sekvencemi vzorků bez potřeby offline frakcionace, což zkracuje dobu experimentu a minimalizuje variační zdroje. Platforma je vhodná pro rutinní biomarkerové studie, QA/QC v průmyslu a vysokopropustné laboratoře s požadavkem na robustní kvantifikaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s datově nezávislým zpracováním (DIA) pro ještě širší proteomický pokryv.
• Automatizace přípravy vzorků a kratší gradienty pro vysokopro­pustné screeningy.
• Využití pokročilých ion mobility technologií a umělé inteligence pro analýzu komplexních dat.
• Nasazení v klinických laboratořích pro personalizovanou medicínu a monitoring léčby.

Závěr

Demonstrace mikropro­udové LC-MS platformy ukazuje vynikající kombinaci robustnosti, reprodukovatelnosti a výkonnosti v různých proteomických aplikacích. FAIMS Pro Duo výrazně rozšiřuje hloubku profilování bez prodloužení celkové doby analýzy, což dělá platformu ideální volbou pro rozsáhlé kvantitativní studie.

Reference

• Yang Liu et al. Benchmark of Micro-flow Chromatograph for Robust Proteomics Analysis, Thermo Fisher Scientific, 2021.