A TMTpro 18plex Proteomics Standard for Assessing Protein Measurement Accuracy and Precision

Význam tématu

Precizni mereni obsahu proteinu hraje klicovou roli v biomarkerovem vyzkumu, kvalitativni a kvantitativni kontrole laboratnich procesu a vyvoji novych analytickych metod. Standardni referencni materialy zalozene na multiplexnich barvivach TMTpro 18plex umoznuji systemove nastaveni a validaci high throughput LC MS workflow.

Cíle a přehled studie / článku

Clanek popisuje konstrukci noveho TMTpro 18plex yeast digest standardu zalozeneho na trech knockout strainach Saccharomyces cerevisiae a parentalnim kmenu. Cilem je hodnotit presnost a pricnost proteinove kvantifikace pri ruznych akvizicnich rezimech MS2, SPS MS3 a real time search MS3 (RTS).

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: parentalni kmen BY4741 a knock out strainy Met6, His4, Ura2; kulturace v YPD broth do OD 3 0/mL, lysa bead beating, redukce, alkylace, digest s Trypsin a LysC
• Labeling: TMTpro 18plex s triplicitnim oznacovanim knockout kanalu a duplikatni kazdeho parentalniho kanalu; standardni krivky s pevne definovanymi pomery (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 0 procent)
• Instrumentace: Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid a Exploris 480 s volitelnym FAIMS Pro interface; EASY Spray C18 kolona (50 cm) s UltiMate 3000 RSLCnano a EASY-nLC 1200 UHPLC systemem
• Akvizicni rezimy: hrMS2, SPS-MS3 a RTS-MS3; MS1 rozliseni 120 000, MS2 50 000, MS3 50 000, izolacni okno 0,7 m/z, cid NCE 35, hcd NCE 65, injektacni casy 50-200 ms, dynamic exclusion 20 s
• Software a analyza: Proteome Discoverer 2,5 a 3,0 se SEQUEST HT a COMET enginy, 1 procent false discovery rate, ko izolacni mez 50 procent pro MS2 a 70 procent pro SPS-MS3

Hlavní výsledky a diskuse

• SPS-MS3 zajistilo nejvyssi presnost a nejnizsi odchylky oproti klasickemu MS2 rezimu
• Pouziti FAIMS Pro interface vyrazne zlepsilo presnost mereni proteinu pro vsechny aqvizicni strategie
• RTS-MS3 prineslo nejvetsi pocet identifikovanych peptidu a proteinovych skupin a zvysilo kvantifikovatelne proteiny o 26 procent oproti SPS-MS3
• Standardni krivky vykazovaly linearitu nad 0,98 pro C1-C4 diluce; pri nejnizsi koncentraci linearita poklesla na 0,90
• RTS-MS3 snizil pozadi a interferenci v knockout kanalech, crispe se blizil teorii

Přínosy a praktické využití metody

• Umocnuje komplexni validaci a optimalizaci multiplexniho proteomickeho workflow
• Poskytuje referencni material pro posouzeni vykonnosti instrumentu a volby akvizicni strategie
• Podporuje vyvoj reprodukovatelnych protokolu v akademickem i prumyslovem prostredi

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace RTS s AI ridicimi moduly pro dalsi zlepseni presnosti a rychlosti
• Aplikace na biofarmaceuticke vzorky a klinicke multiplexni studie
• Vyvoj dalsich standardu pro ruzne organismy a posttranslacni modifikace
• Implementace orthogonalnich separacnich technologii ke snizeni interference

Závěr

TMTpro 18plex yeast digest accuracy standard predstavuje robustni nastroj pro hodnoteni presnosti a preci v multiplexni proteomicke kvantifikaci. Integrace RTS-MS3 a FAIMS Pro rozhrani vedla k vyraznemu zvyseni poctu identifikaci a k minimalizaci interference, usnadnuje optimalizaci pristroju a protokolu v ruznych aplikacich.

Reference

1. Paulo JA OConnell JD a Gygi SP (2016) A triple knockout TKO proteomics standard for diagnosing ion interference in isobaric labeling experiments Journal of the American Society for Mass Spectrometry 27(10):1620-1625 DOI 10.1007/s13361-016-1434-9