Development of Mass Spectrometry-Screening Methods for Quality Assessment of Cryo-EM Standard

Význam tématu

Vysoké rozlišení v kryo-elektronové mikroskopii (Cryo-EM) závisí na kvalitě přípravku. Homogenita, stabilita a správné složení proteinových komplexů jsou klíčové pro úspěšné získání struktury. Hmotnostní spektrometrie (MS) nabízí rychlou a citlivou kontrolu kvality biomolekul ještě před zmražením vzorku do vitreózního ledu, čímž zkracuje čas a snižuje náklady na optimalizaci podmínek přípravy.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a porovnat různé nástroje MS-screeningu pro kontrolu kvality lidského apoferritinu (24-mer, ~500 kDa) jako standardu pro Cryo-EM. Studie zahrnovala:

• Infuzi nativního komplexu
• Separaci SEC-MS
• Online buffer exchange MS (OBE-MS)

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek apoferritinu byl exprimován v Escherichia coli s GST tagem, který byl odstraněn TEV proteázou, následovala dialýza a SEC purifikace. Pro chromatografii byly použity:

• MAbPac SEC-1 kolona (2,1×15 cm)
• Prototyp OBE kolony (2,1×3 cm)
• Mobilní fáze: 50–200 mM amoniumacetát

MS analýzy probíhaly na systémech Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex UHPLC a Q Exactive™ UHMR MS. Pro analýzu spekter se využívaly softwary Freestyle 1.8, BioPharma Finder 4.1 a pro Cryo-EM Relion 3.1. Kryo-EM obrazy byly pořízeny na Titan Krios G4 s Falcon4 detektorem.

Hlavní výsledky a diskuse

1) Potvrzení sekvence monomeru: Pseudo-MS3 metody prokázaly 52 % pokrytí sekvence b- a y-ionty.
2) Složení komplexu a homogenita: Native SEC-MS i OBE-MS odhalily hlavní 24-mer apoferritin a menší podíly agregátů či misfolding produktů.
3) Stabilita a agregace: U skladovaných vzorků (4 °C, –20 °C, –80 °C) dochází k postupnému nárůstu agregace a nesprávně složených forem s délkou skladování.
4) Rychlost screeningových metod: OBE-MS umožňuje analýzu pod 5 min, SEC-MS 15–20 min, infuze bez separace trvá nejdéle.
5) Korelace s kvalitou Cryo-EM: Vzorky vybrané podle MS monitoringu vykazovaly vyšší podíl homogenních částic při Cryo-EM snímání.

Přínosy a praktické využití metody

• Urychlení identifikace optimálních preparativních podmínek pro Cryo-EM gridy.
• Finanční úspora díky včasné detekci nevhodných vzorků.
• Podpora rozhodování při výrobě standardních proteinových preparátů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace OBE-MS do plně automatizovaných QC workflow.
• Rozšíření metod na další proteinové komplexy a přidružené ligandové systémy.
• Využití strojového učení pro automatickou interpretaci spekter a předpověď stability.
• Další zrychlování analýzy prostřednictvím vylepšených ionizačních technik.

Závěr

Vyvinuté nativní MS metody (infuze, SEC-MS, OBE-MS) prokázaly vysokou spolehlivost při hodnocení kvality apoferritinu jako Cryo-EM standardu. Rychlý screening a schopnost kvantifikovat agregaci i misfolding umožňují cílenou optimalizaci přípravy vzorků, což vede k lepším výsledkům v Cryo-EM studiích.

Reference

1. Van Aernum et al. Nat Protoc. 2020 Mar;15(3):1132–1157
2. Kafader JO et al. Nat Methods. 2020 Apr;17(4):391–394