Increased sensitivity and throughput for native intact mass analysis using a NativePac OBE-1 SEC column and an Orbitrap Ascend Tribrid mass spectrometer

Význam tématu

Přesná a citlivá analýza struktur terapeutických proteinů, zejména monoklonálních protilátek (mAb), je klíčová pro kontrolu kvality, vývoj bioprocesů a regulaci léčiv. Nativní hmotnostní spektrometrie umožňuje zachování nekovalentních interakcí a detailní charakterizaci glykozylace a mikroheterogenity proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo implementovat online výměnu pufru (online buffer exchange, OBE) pomocí kolony NativePac OBE-1 ve spojení s UHPLC Vanquish Horizon a Orbitrap Ascend Tribrid MS pro rychlou a vysoce citlivou nativní analýzu intactní hmotnosti mAb. Studie ukazuje fízí koncepční využití krátké SEC kolony při mikrotokových podmínkách a automatizované zpracování dat.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl použit systém Vanquish Horizon UHPLC s následujícími moduly:

• NativePac OBE-1 SEC columna (2,1 × 50 mm, 80 Å, 3 µm) při 65 µL/min, 50 mM acetátamonného pufru, 30 °C.
• MAbPac SEC-1 columna (4 × 300 mm, 300 Å, 5 µm) při 250 µL/min pro srovnání.
• Orbitrap Ascend Tribrid MS s HMRn+ volbou; ESI parametry: napětí 3 500 V, teplota kapiláry 275 °C, vaporizer 175 °C.
• Data processing offline v BioPharma Finder 5.2 (ReSpect algoritmus) a v reálném čase OptiMSe 1.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza intactní hmotnosti NISTmAb prokázala:

• Rychlost níže než 5 min na vzorek s rozlišením glycoform pod 10 ppm.
• Detekci až 5 ng mAb na kolonu s kvalitním spektrem (S/N>50) díky mikroflow rychlosti.
• Vyšší signál-šum poměr ve srovnání s konvenční MAbPac SEC-1 kolónou.
• Účinné oddělení proteinu od nevolatilních solí a automatická dekonvoluce dat.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácená doba analýzy a vyšší průchodnost (4,5 min na vzorek).
• Minimalizace přípravy vzorku díky online desaltingu.
• Vysoká citlivost umožňující úsporu vzorku v QA/QC, vývoji procesů a biofarmaceutickém výzkumu.
• Jednoduché nastavení metod díky přednastaveným šablonám v software.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace automatizovaných workflow s LIMS, rozšíření aplikací na komplexní proteinové komplexy a vazebné studie, zlepšení algoritmů pro dekonvoluci polymorfních vzorků a kompatibilita s pokročilými MS platformami.

Závěr

Implementace NativePac OBE-1 kolony a Orbitrap Ascend Tribrid MS výrazně zrychluje a zpřesňuje nativní intactní hmotnostní analýzu mAb. Kombinace mikroflow SEC a softwaru OptiMSe umožňuje vysokou citlivost, rychlé zpracování dat a automatické reportování, což podporuje efektivní screening a vývoj proteinových terapeutik.

Reference

1. Thermo Fisher Scientific. OptiMSe workflows for fast sample screening.
2. Thermo Scientific Technical Note 001259: Solutions for high-throughput analysis of large biomolecules by native mass spectrometry, 2022.
3. Thermo Scientific OptiMSe Workflow brochure.