Sensitive Measurement of Hydroxy Metabolites of Vitamin D and Respective Epimers using LC-MS/MS which Overcomes Challenges of Chemiluminescent Immunoassay

Význam tématu

Vitamin D je skupina lipofilních secosteroidů, jejichž cirkulující hydroxy metabolity 25(OH)D2 a 25(OH)D3 slouží jako klíčové biomarkery stavu vitaminu D v klinických i výzkumných aplikacích. Přítomnost epimerů těchto metabolitů komplikuje jejich kvantifikaci tradičními chemiluminiscenčními imunotesty, což může vést k nepřesnostem.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a validovat rychlou a citlivou LC-MS/MS metodu, která umožňuje současnou chromatografickou baseline separaci a přesné stanovení 25(OH)D2, 25(OH)D3 a jejich C3-epimerů v séru, aniž by docházelo k interferencím mezi izobarickými formami.

Použitá metodika

Vzorek séra (200 µl) podléhá precipitaci proteinů metodou přidání orgánického rozpouštědla, následuje vortex, inkubace a centrifugace po dobu 15 minut. Supernatant je injikován do LC systému za následujících podmínek:

• Kolona: Agilent InfinityLab Poroshell 120 PFP 3,0×100 mm, 2,7 µm, teplota 20 °C
• Mobile phase A: voda s 0,1 % kyseliny mravenčí
• Mobile phase B: methanol s 0,1 % kyseliny mravenčí
• Gradient: 65–95 % B v průběhu 8,5 min, celkový čas 10 min při průtoku 0,55 ml/min

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II pumpa
• Agilent 1260 Infinity II multisampler se 0,3 µm inline filtrem
• Agilent 1260 Infinity II multicolumn compartment
• Agilent Ultivo LC/TQ s Agilent Jet Stream (AJS) zdrojem

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou citlivost (LOD 0,4–1 ng/ml, LOQ 1–2 ng/ml) a lineární odezvu v rozsahu 0,4–200 ng/ml (R2 > 0,999). Precizita retence (<0,3 % RSD) a odezvy (<5 % RSD) byla na velmi dobré úrovni. Absolutní přesnost se pohybovala mezi 95 a 115 %, recovery 91–111 % s intra-batch RSD ≤ 2 %. Matricový efekt byl mírný (ME > 87 %), což potvrzuje robustnost analýzy. Robustnost metody byla ověřena 500 kontinuálními injekcemi MQC vzorku po dobu 3,5 dne, kdy byly u všech analyzovaných látek dosaženy RSD <5 % pro koncentraci a <0,2 % pro retenci.
Testování pomocí referenčních standardů Chromsystems potvrdilo baseline separaci 25(OH)D3 vs. epimer a 25(OH)D2 vs. epimer, s průměrnou recoverií 97–109 % a RSD ≤ 4 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí specifickou a robustní kvantifikaci vitamin D metabolitů a epimerů v séru s krátkým časem analýzy (10 min), což ji předurčuje pro rutinní klinickou diagnostiku, QA/QC v analytických laboratořích a výzkumné studie v oblasti lipidomiky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody o stanovení dalších vitamin D derivátů a secosteroidů
• Integrace do automatizovaných laboratorních linek pro vysokopropustné analýzy
• Analýza velkých kohortních studií pro epidemiologický výzkum
• Propojení s multidisciplinární lipidomickou charakterizací patofyziologických stavů

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda s použitím Agilent Ultivo LC/TQ umožňuje rychlou, přesnou a citlivou chromatografickou separaci a kvantifikaci 25(OH)D2, 25(OH)D3 a jejich epimerů v rámci jednoho desetiminutového běhu. Robustní výkon a shoda s referenčními standardy podporují její aplikaci v klinických i výzkumných podmínkách.

Reference

Nevyžadováno formální uvedení literatury.