Exact Structure Identification of Isomeric N-Glycans by High‑Resolution Ion Mobility LC/Q‑TOF

Význam tématu

Glykanové modifikace představují jednu z nejkomplexnějších posttranslačních změn proteinů a hrají zásadní roli v biologických a patologických procesech. Přesná identifikace izomerních N-glykanů je klíčová pro porozumění jejich funkci, pro výzkum biomarkerů a kvalitu biofarmaceutik.

Cíle a přehled studie

Cílem apliké poznámky bylo prokázat, že kombinace vysokorozlišného iontově-mobilitního spektrometru s LC a speciální multiplexací umožňuje rychlou, přímou a jednoznačnou identifikaci přesných struktur izomerních N-glykanů uvolněných z erytrocytů potkana. Studie využívá konformační fingerprinty získané z arrival time distribution k odlišení isomerů.

Použitá metodika a instrumentace

Uvolnění N-glykanů:

• Célově izolovaná glykoproteiny z erytrocytů potkana; štěpení enzymem Endo F2
• Odstranění sialových zbytků kyselinou octovou (2 M, 72 h, 65 °C)
• Derivatizace reduktivní aminací 2-aminobenzoovou kyselinou (2-AA)
• Čištění PGC SPE kartáčemi a minitrap G-10

Chromatografická analýza:

• Agilent 1290 Infinity II LC
• Thermo Fisher Hypercarb PGC kolona (100 × 2,1 mm, 3 µm), 75 °C
• Gradient amonné formiátové pufru a acetonitrilu, průtok 0,2 mL/min

Iontová mobilita a hmotnostní spektrometrie:

• Agilent 6560 IM LC/Q-TOF s Jet Stream zdrojem
• Negativní iontový režim, m/z 100–1700
• Multiplexní pulzování 4-bit, driftová trubice N2 při 3,95 Torr
• Demultiplexing PNNL PreProcessor Beta 3.0, HR demultiplexing HRdm 2.0

Hlavní výsledky a diskuse

Vybrané standardy N-glykanů (1–8) vykázaly jedinečné conformer distribution fingerprinty s vysokým rozlišením (až Ω/ΔΩ = 267). Extrahované iontové chromatogramy glykanů z erytrocytů odhalily přítomnost izomerních forem pro analyty s m/z 697,25, 778,28 a 960,84. Porovnáním ATD a vypočtených CCS s referenční databází byl každý izomer jednoznačně identifikován. Standardy 6–8 nebyly ve vzorku detekovány, což potvrdilo selektivitu metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou a spolehlivou identifikaci izomerů bez potřeby rozsáhlých MSn experimentů
• Možnost využití pro výzkum glykomiky, kvalitu biopharmaceutik a klinické testy
• Vytvoření databáze CDF fingerprintů pro další aplikace

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj metody lze směřovat k:

• Rozšíření databází glykanových fingerprintů pro různé biologické zdroje
• Integraci on-line glykochromatografie s IM-MS pro vysokopropustné analýzy
• Automatizaci datové analýzy a využití strojového učení pro dešifrování komplexních směsí
• Implementaci v kvalitativní a kvantitativní kontrole bioproduktů

Závěr

Kombinace vysokorozlišné iontové mobility s LC/Q-TOF a pokročilým demultiplexingem umožňuje jednoznačné a rychlé přiřazení struktury izomerních N-glykanů. Metoda přináší robustní přístup pro glykanovou analýzu v biomedicínském výzkumu i průmyslové kvalitativní kontrole.

Reference

1. Sastre Torano J et al. Identification of Isomeric N-Glycans by Conformer Distribution Fingerprinting using Ion Mobility Mass Spectrometry. Chem Eur J. 2021;27(6):2149–2154.
2. Broszeit F et al. N-Glycolylneuraminic Acid as a Receptor for Influenza A Viruses. Cell Reports. 2019;27(11):3284–3294.e6.
3. Liu L et al. Streamlining the Chemoenzymatic Synthesis of Complex N-glycans By a Stop and Go Strategy. Nature Chemistry. 2018;11(2):161–169.
4. Ruhaak LR et al. Glycan Labeling Strategies and Their Use in Identification and Quantification. Anal Bioanal Chem. 2010;397(8):3457–3481.
5. Aich U et al. Glycomics-Based Analysis of Chicken Red Blood Cells Provides Insight into the Selectivity of the Viral Agglutination Assay. FEBS Journal. 2011;278(10):1699–1712.
6. Bilbao A et al. A Preprocessing Tool for Enhanced Ion Mobility-Mass Spectrometry-Based Omics Workflows. J Proteome Res. 2021.
7. May JC et al. Resolution of Isomeric Mixtures in Ion Mobility Using a Combined Demultiplexing and Peak Deconvolution Technique. Anal Chem. 2020;92(14):9482–9492.