SOUČASNÝ VÝVOJ V PROTEOMICE

Význam tématu

Proteomika je klíčovým oborem moderní biochemie zaměřeným na komplexní analýzu proteinů, které odrážejí skutečný funkční stav buňky či organismu. Zatímco genom poskytuje statický obrázek genetického potenciálu, proteomika odhaluje dynamiku expresních hladin, post-translačních modifikací a interakcí protein-protein. Její využití je zásadní v mnoha oblastech – od objasnění regulačních mechanismů, přes biomarkerovou diagnostiku, až po cílený vývoj nových léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Přehledný článek shrnuje současné metody a aplikace proteomiky, včetně dvoudimenzionální gelové elektroforézy (2-DE), hmotnostní spektrometrie (MS), izotopového značení (ICAT), multidimenzionální LC-MS/MS (MudPIT) a nových čipových technik. Diskutuje silné stránky a limity jednotlivých přístupů a ilustruje aplikace ve srovnávací analýze proteinových vzorků, studiu post-translačních modifikací, interakcí protein-protein a ve farmaceutické i klinické praxi.

Použitá metodika a instrumentace

• 2-DE: isoelektrická fokusace v IPG pasech (pH 3–12) + SDS-PAGE gradient (8–16 %) pro separaci až tisíců proteinů.
• Barvení gelů: fluorescenční značky, DIGE – simultánní analýza až 3 vzorků na jednom gelu.
• MS detekce a identifikace: MALDI-TOF, ESI-MS, tandemová MS pro lokalizaci modifikací.
• Izotopové značení: ICAT pro kvantitativní srovnání vzorků „lehké”/„těžké”.
• Multidimenzionální LC-MS/MS (MudPIT) pro analýzu vzorků se složitým dynamickým rozpětím koncentrací.
• Afinitní techniky: IMAC pro obohacení fosfopeptidů, konkanavalin A pro glykoproteiny, pseudopeptid-fosfinátové nosiče pro purifikaci Zn-metaloenzymů (např. betain-homocystein S-methyltransferasy).
• Proteinové čipy: SELDI-MS, protein-function arrays a protein-detecting arrays pro paralelní studium aktivity, interakcí a kvantifikaci proteinů.

Hlavní výsledky a diskuse

Recenze ukazuje, že kombinace 2-DE a MS umožňuje identifikaci tisíců proteinů i s jejich post-translačními modifikacemi, avšak omezeně detekuje proteiny ve velmi nízkých či vysokých koncentracích a hydrofobní membránové proteiny. MudPIT odhalil u kvasinky až 1 500 proteinů včetně bazických a membránových typů. ICAT a DIGE významně zlepšují kvantitativní srovnání dvou stavů. Afinitní purifikace s chemickými nosiči demonstrovala výběrovou izolaci enzymů přímo z buněčných homogenátů. Proteinové čipy slibují vysokou propustnost, ale zatím řeší především definované sady proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

• Biomarkery: identifikace proteinových markerů v biologických tekutinách (plasma, moč, mozkomíšní mok) pro onemocnění ledvin, nádorová onemocnění, Alzheimerovu chorobu.
• Farmakologie: odhalení mechanismu účinku léků (např. lovastatin na jaterní proteomy) a cílových proteinů pro nové terapeutické inhibitory.
• Biotechnologie: optimalizace výroby rekombinantních proteinů a studium regulačních sítí v buňkách modelových organismů.
• Microbiologie: stanovení patogenních proteinů a mechanismů antibakteriální rezistence.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozvoj čipových technologií pro proteomické paralelní analýzy, zdokonalení kvantitativních přístupů s izotopy stabilních prvků, nové metody pro membránové a nízkoabundantní proteiny a integrace proteomických dat s genomikou a transkriptomikou. Velký potenciál mají mezinárodní databázové projekty a sdílení dat pro výzkum interakcí a funkcí proteinových sítí.

Závěr

Proteomika nabízí jedinečný pohled na funkční složení buňky a organismu. Pokrok v metodách separace, detekce, kvantifikace a bioinformatické analýze otevírá široké možnosti aplikací v medicíně, farmakologii a biotechnologii. Budoucí výzvou je zvýšit citlivost, rozšířit dynamické rozpětí detekce a navázat standardizované sdílení proteomických dat.

Reference

1. Adams M. D. et al.: Science 287, 2185 (2000)
2. The C. elegans Sequencing Consortium: Science 282, 2012 (1998)
3. The Arabidopsis Genome Initiative: Nature 408, 796 (2000)
4. International Human Genome Sequencing Consortium: Nature 409, 860 (2001)
5. Collins F. S. et al.: Science 300, 286 (2003)
6. Lottspeich F.: Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 38, 2476 (1999)
7. Rao P. V. et al.: J. Biol. Chem. 273, 30669 (1998)
8. Abbott A.: Nature 402, 715 (1999)
9. Jenkins R. E., Pennington S. R.: Proteomics 1, 13 (2001)
10. Pandey A., Mann M.: Nature 405, 837 (2000)
11. Eisenberg D. et al.: Nature 405, 823 (2000)
12. Klose J., Kobalz U.: Electrophoresis 16, 1034 (1995)
13. Corthals G. L. et al.: Electrophoresis 21, 1104 (2000)
14. Anderson N. L., Anderson N. G.: Electrophoresis 19, 1853 (1998)
15. Görg A. et al.: Electrophoresis 21, 1037 (2000)
16. Quadroni M., James P.: Electrophoresis 20, 664 (1999)
17. Righetti P. G. et al.: Proteomics 3, 1397 (2003)
18. Lopez M. F.: Electrophoresis 21, 1082 (2000)
19. Lopez M. F. et al.: Electrophoresis 21, 3427 (2000)
20. Rabilloud T.: Electrophoresis 19, 758 (1998)
21. Herbert B. R. et al.: Electrophoresis 19, 845 (1998)
22. Molloy M. P. et al.: Electrophoresis 19, 837 (1998)
23. Santoni V. et al.: Electrophoresis 21, 1054 (1999)
24. Deshusses J. M. P. et al.: Proteomics 3, 1418 (2003)
25. Görg A. et al.: Electrophoresis 20, 712 (1999)
26. Görg A. et al.: Electrophoresis 9, 531 (1988)
27. Washburn M. P., Wolters D., Yates J. R. 3.: Nat. Biotechnol. 19, 242 (2001)
28. Wolters D. A. et al.: Anal. Chem. 73, 5683 (2001)
29. Washburn M. P. et al.: Anal. Chem. 74, 1650 (2002)
30. Gygi S. P. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 9390 (2000)
31. Link A. J. et al.: Nat. Biotechnol. 17, 676 (1999)
32. Collinsová M., Jiráček J.: Chem. Biol. 10, 113 (2003)
33. Collinsová M., Jiráček J.: Curr. Med. Chem. 7, 629 (2000)
34. Dive V. et al.: Biochem. Soc. Trans. 28, 455 (2000)
35. Nuhse T. S. et al.: Proteomics 2, 1234 (2003)
36. Blackstock W. P., Weir M. P.: Trends Biotechnol. 17, 121 (1999)
37. Templin M. F. et al.: Proteomics 3, 2155 (2003)
38. Wells W. A.: Chem. Biol. 6, R259 (1999)
39. Kodadek T.: Chem. Biol. 8, 105 (2001)
40. MacBeath G., Schreiber S. L.: Science 289, 1760 (2000)
41. Cho S. et al.: J. Biochem. Mol. Biol. 37, 45 (2004)
42. Celis J. E. et al.: Cancer Res. 59, 3003 (1999)
43. Spahr C. S. et al.: Proteomics 1, 93 (2001)
44. Wulfkuhle J. D. et al.: Nat. Rev. Cancer 3, 267 (2003)
45. Alaiya A. A. et al.: Electrophoresis 21, 1210 (2000)
46. Witzmann F. A. et al.: Electrophoresis 21, 2138 (2000)
47. Rohlff Ch.: Electrophoresis 21, 1227 (2000)
48. Perrot M. et al.: Electrophoresis 20, 2280 (1999)
49. Celis J. E. et al.: FEBS Lett. 430, 64 (1998)
50. Jung E. et al.: Electrophoresis 21, 3369 (2000)
51. Fountoulakis M. et al.: Electrophoresis 23, 311 (2002)
52. Newton A. D. et al.: Proteomics 3, 1162 (2003)
53. Collinsová M., Jiráček J.: nepublikované výsledky