PROTEOMIKA V POSTGENOMOVÉ DOBĚ

Význam tématu

Proteomika představuje klíčovou disciplínu po dokončení projektů genomického sekvenování. Zatímco genomika mapuje potenciální genetický rejstřík, proteomika odhaluje skutečné množství, strukturu, modifikace a interakce bílkovin v konkrétních buněčných a tkáňových souborech. Díky tomu poskytuje bezprostřední vhled do funkčních mechanismů organismů, změn spojených s nemocemi, vývojem či adaptací na vnější podmínky.

Cíle a přehled článku

Článek shrnuje historický vývoj proteomiky od jejího vzniku v polovině 90. let až po současné pokročilé metody dělení, identifikace a kvantifikace proteinů. Popisuje klíčové kroky od dvourozměrné gelové elektroforézy přes hmotnostní spektrometrii až po moderní chromato-graficko-spektrometrické přístupy a stabilní izotopové značení. Diskutuje rovněž aplikace v proteinovém profilování, mapování posttranslačních modifikací a studiu proteinových interakcí.

Použitá metodika a instrumentace

Hlavní metody popsané ve studii:

• Dvourozměrná gelová elektroforéza (2DE) se stacionárními pH gradienty pro separaci proteinů podle izoelektrického bodu a molekulové hmotnosti.
• MALDI-TOF a ESI-MS pro rychlé měření m/z poměrů proteinů a peptidů a jejich databázové porovnávání (peptidové mapování).
• Kapalinová chromatografie s reverzní fází spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-ESI-MS/MS) pro analýzu komplexních směsí proteolytických peptidů.
• Stabilní izotopové značení (ICAT, SILAC, 18O) pro relativní kvantifikaci proteinů.

Použitá instrumentace

• Imobilizované pH gradienty pro 2DE
• MALDI-TOF (time-of-flight)
• ESI napojené na iontové pasti (IT), kvadrupoly (Q), Q-TOF a FT-ICR analyzátory
• Kolizní cely pro MALDI-TOF/TOF
• Reverzní fáze HPLC kolony spojené s ESI-MS

Hlavní výsledky a diskuse

Studie ilustruje, že proteomika se rychle vyvinula od pomalých sekvenačních metod Edmanovou degradací k vysoce citlivým hmotnostním spektrometrům spojujícím LC a MS/MS. Zlepšila se reprodukovatelnost 2DE díky imobilizovaným pH gradientům i kvantifikace pomocí fluorescenčního značení (DIGE). Hybridní analyzátory Q-TOF či FT-ICR přinášejí vysoké rozlišení a přesnost. Izotopové značky umožňují sledovat relativní změny v proteinech během fyziologických či patologických procesů. Rovněž je možné analyzovat posttranslační modifikace a proteinové komplexy, avšak stále představují výzvu nízká stechiometrie PTM a nutnost jemné purifikace interagujících proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

Proteomika nachází uplatnění v biomedicíně (hledání biomarkerů), farmaceutickém výzkumu (cílená terapie), zemědělství (vývoj odolných odrůd), ekologii (adaptace organismů na stres) i kvalitativní/kvantitativní kontrole potravin a průmyslových výrobků. Dopomáhá k objasnění biologických drah, diagnostice onemocnění a monitoringu terapeutických zásahů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávají se další posuny k vyšší citlivosti a rychlosti analýz, široké nasazení multiplexních kinázových čipů, cílené kvantitativní přístupy (SRM/MRM) a integrace s genomikou a dalšími „omics“. Mezinárodní organizace HUPO, EuPA a národní proteomické spolky sjednocují snahy k mapování lidského i druhově specifických proteomů. Personalizovaná medicína a systé­mové modelování buněčných sítí budou dále posilovat význam proteomiky.

Závěr

Proteomika se etablovala jako nezbytný nástroj pro komplexní studium funkčních projevů genome – zkoumá bílkovinnou složku buňky v reálných podmínkách. Díky neustálému vývoji metod a instrumentace dosahuje vysoké specificity, citlivosti i kvantifikační schopnosti. Přesto zůstávají výzvy v analýze nízko zastoupených proteinů, PTM a dynamických interakcí, které budou předmětem dalšího výzkumu.

Reference

• Wilkins M. R.; Sanchez J.-C.; Gooley A. A.; Apper R. D.; Humphery-Smith I.; Hochstrasser D. F.; Williams K. L. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 13 (1995) 19.
• Patterson S. D.; Aebersold R. H. Nat. Genet. Suppl. 33 (2003) 311.
• Aebersold R. H.; Leavitt J.; Saavedra R. A.; Hood L. E.; Kent S. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 6970.
• O’Farrell P. H. J. Biol. Chem. 250 (1975) 4007.
• Scheele G. A. J. Biol. Chem. 250 (1975) 5275.
• Klose J. Humangenetik 26 (1975) 231.
• Hochstrasser D. F.; Merril C. R. Appl. Theor. Electrophor. 1 (1988) 35.
• Fenn J. B.; Mann M.; Meng C. K.; Wong S. F.; Whitehouse C. M. Science 246 (1989) 64.
• Karas M.; Hillenkamp F. Anal. Chem. 60 (1988) 2299.
• Aebersold R. H.; Mann M. Nature 422 (2003) 198.
• Henzel W. J.; Billeci T. M.; Stults J. T.; Wong S. C.; Grimley C.; Watanabe C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 5011.
• Mann M.; Hojrup P.; Roepstorff P. Biol. Mass Spectrom. 22 (1993) 338.
• Pappin D. J. C.; Hojrup P.; Bleasby A. J. Curr. Biol. 3 (1993) 327.
• James P.; Quadroni M.; Carafoli E.; Gonnet G. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195 (1993) 58.
• Yates J. R. III; Speicher S.; Griffin P. R.; Hunkapiller T. Anal. Chem. 214 (1993) 397.
• Griffin T. J.; Aebersold R. H. J. Biol. Chem. 276 (2001) 45497.
• Hunt D. F.; Henderson R. A.; Shabanowitz J.; Sakaguchi K.; Michel H.; Sevilir N.; Cox A. L.; Appella E.; Engelhard V. H. Science 255 (1992) 1263.
• Martin S. E.; Shabanowitz J.; Hunt D. F.; Marto J. A. Anal. Chem. 72 (2000) 4266.
• Medzihradszky K. F.; Campbell J. M.; Baldwin M. A.; Falick A. M.; Juhasz P.; Vestal M. L.; Burlingame A. L. Anal. Chem. 72 (2000) 552.
• Yao X.; Freas A.; Ramirez J.; Demirev P. A.; Fenselau C. Anal. Chem. 73 (2001) 2836.
• Gygi S. P.; Rist B.; Gerber S. A.; Turecek F.; Gelb M. H.; Aebersold R. H. Nat. Biotechnol. 17 (1999) 994.
• Ong S. E.; Blagoev B.; Kratchmarova I.; Kristensen D. B.; Steen H.; Pandey A.; Mann M. Mol. Cell. Proteomics 1 (2002) 376.
• Krishna R.; Wold F. In: Protein structure – A practical Approach (Creighton T. E., ed.), 2nd ed., p. 91. Oxford University Press, New York 1997.
• Simpson R. J. Proteins and Proteomics. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2003.
• Huber L. A. Nat. Rev. 4 (2003) 74.