Released Glycan Analysis of Erythropoietin Using the ACQUITY Premier Glycan BEH C 18 AX Column and BioAccord System with ACQUITY Premier

Význam tématu

Analýza glykosylace, zejména obsahu a struktury vysoce sialylovaných glykánů u bioterapeutik jako erytropoetin, je nezbytná pro hodnocení farmakokinetiky, biologické aktivity a imunogenity léčiv. Přesné určení heterogenity a izomerie glykánových struktur zajišťuje kvalitu a bezpečnost endproduktů biotechnologických procesů.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl porovnat klasickou HILIC-FLR-MS separaci označených N-glykánů s novou smíšeně módní chromatografií na kolonce ACQUITY Premier Glycan BEH C18 AX. Využitým přístupem je RapiFluor-MS značení v kombinaci s BioAccord LC-FLR-MS systémem, s důrazem na zlepšení rozlišení, citlivosti a schopnosti strukturálního přidělení glykánů u uvolněných N-glykánů erytropoetinu.

Použitá metodika

Vzorky erytropoetinu byly denaturovány, enzymaticky odštěpeny N-glykany a označeny fluorescenčním RapiFluor-MS tagem. Pro chromatografii byly optimalizovány dva režimy: tradiční HILIC s amide kolonkou a smíšený mód na C18 AX kolonce s postupným gradientem upravených mobilních fází.

Použitá instrumentace

• BioAccord LC-FLR-MS systém s ACQUITY Premier UPLC
• ACQUITY Premier Glycan BEH C18 AX kolonka (1.7 µm, 2.1×150 mm) a BEH Amide kolonka pro HILIC
• ACQUITY Premier FLR detektor (λexc 265 nm, λem 425 nm)
• ACQUITY RDa hmotnostní detektor, ESI+ režim, 50–2000 m/z, fragmentace 70–90 V

Hlavní výsledky a diskuse

Smíšený mód prokázal jasnou selektivitu podle počtu sialových zbytků, přičemž v rámci každé skupiny se glykány dále oddělovaly podle hydrofility. Průměrná šířka píků byla o 20 % menší než u HILIC. Na kolonce C18 AX bylo detekováno 82 unikátních N-glykánů z erytropoetinu. Izomerní formy FA4S3 dosahují téměř baseline separation. RapiFluor-MS značení výrazně zlepšilo signál v MS a umožnilo potvrzení stopových glykánů od 0.1 % relativní koncentrace.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená selektivita a kapacita pro vysoce sialylované komplexní glykány
• Snížení spotřeby vzorku a zkrácení času analýzy oproti dvoufázovým postupům
• Rychlé porovnání glykoproteinů z různých šarží
• Zajištění konzistence a kvality bioterapeutik v kontrolovaném prostředí QC

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další automatizace procesu, integrace do pokročilých datových platforem pro řízení kvality a rozšíření aplikací na jiné komplexní glykoproteiny. Kombinace smíšeného módu s multidimenzionálními přístupy je perspektivní pro hlubší charakterizaci glykánových struktur.

Závěr

Metoda založená na ACQUITY Premier Glycan BEH C18 AX kolonce, RapiFluor-MS značení a BioAccord LC-FLR-MS poskytuje významné zlepšení v rozlišení, citlivosti a strukturálním potvrzení u vysoce sialylovaných N-glykánů erytropoetinu, čímž zvyšuje spolehlivost analýzy pro biotechnologický průmysl.

Reference

1. Zhang P. et al. Challenges of Glycosylation Analysis and Control: An Integrated Approach to Producing Optimal and Consistent Therapeutic Drugs. Drug Discovery Today 2016;21(5):740–765.
2. Bones J. et al. 2D-LC Analysis of BRP 3 Erythropoietin N-glycosylation Using Anion Exchange Fractionation and HILIC UPLC. Anal. Chem. 2011;83(11):4154–4162.
3. Udayanath A. et al. Separation of 2AB labeled N-glycans from Bovine Fetuin on a Novel Mixed-Mode Stationary Phase. Thermo Fisher Scientific Application Note 2075A.
4. Liu X. et al. Increased Resolving Power for Acidic Glycans with an MS-Compatible Anion Exchange Reversed-Phase Separation. Waters Application Note 720007038, 2020.