Increased Resolving Power for Acidic Glycans with an MS-Compatible Anion Exchange Reversed Phase Separation

Význam tématu

Analýza kyselých N-glykanů je klíčová při hodnocení kvality bioterapeutik, neboť ovlivňuje jejich stabilitu, účinnost a imunogenitu. Sialylace a jiné kyselé modifikace mohou zásadně měnit farmakokinetiku a biologický účinek léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit nový mixed-mode aniontově-exch.a reverzní fází ACQUITY PREMIER Glycan BEH C18 AX Column vybavený HPS povrchem pro optimalizované dělení kyselých glykanů derivatizovaných MS-zvýrazňujícími štítky jako RapiFluor-MS a tradičním 2-AB.

Použitá instrumentace

• UPLC systém ACQUITY UPLC H-Class Bio
• Hmotnostní spektrometr Xevo G2-XS QTof s ESI v pozitivním módu
• Softwary MassLynx v4.1 a UNIFI v1.8

Použitá metodika

Vzorky byly připraveny z komerčních glykanových standardů (RapiFluor-MS sialylované, RapiFluor-MS neutrální, 2-AB Bovine Fetuin). Chromatografie probíhala na kolóně BEH C18 AX (1.7 µm, 2.1×150 mm) při 60 °C s mobilní fází A voda a B 10% IonHance Glycan C18 AX v 40/60 v/v voda/ACN obsahující amforemát. Detekce fluorescenční i hmotnostní.

Hlavní výsledky a diskuse

Nová kolona umožnila rozdělení glykanů podle náboje s lineárním vztahem retence k netto náboji. Dála se spolehlivě odlišit izomerické formy s NeuAc a NeuGc a detekovat glykanové složky do femtomolární citlivosti. Porovnání s konkurenčním AX RPLC prokázalo vyšší rozlišení (Rs 3.1 vs 1.1) a nižší požadavek na zvýšenou iontovou sílu pro eluci vysoce sialylovaných glykanů. HPS povrch minimalizoval ztráty na kovových plochách a zajistil reprodukovatelnost i při prvním použití.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší rozlišení izomerů a kyselých glykanů
• Optimalizace pro MS-zvýrazňující štítky
• Zvýšená recovery glykanů díky inertnímu HPS povrchu
• Kompatibilita s existujícími postupy přípravy vzorku pro HILIC

Budoucí trendy a možnosti využití

Další aplikace se zaměří na analýzu fosforylovaných glykanů a enzymatických přípravků pro léčbu lyzosomálních chorob. Očekává se rozšíření metodiky na komplexní glykomické profily a integrace do QA/QC procesů v bioprodukci.

Závěr

ACQUITY PREMIER Glycan BEH C18 AX Column představuje robustní řešení pro separaci kyselých N-glykanů derivatizovaných různými štítky. Díky mixed-mode separaci a HPS technologii nabízí vysoké rozlišení, reprodukovatelnost a citlivost vhodnou pro krytí kritických kvalitativních atributů bioterapeutik.

Reference

• Varki A. Sialic Acids in Human Health and Disease. Trends Mol Med 2008;14(8):351-360.
• Bones J et al. Identification of N-glycans Displaying Mannose-6-phosphate and Their Site of Attachment on Therapeutic Enzymes for Lysosomal Storage Disorder Treatment. Anal Chem 2011;83(13):5344-53452.
• Lauber MA et al. Rapid Preparation of Released N-glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection. Anal Chem 2015;87(10):5401-5409.
• Lauber MA et al. Waters Application Note 720006930EN 2020.
• Nguyen DH et al. Effects of Natural Human Antibodies Against a Nonhuman Sialic Acid that Metabolically Incorporates into Activated and Malignant Immune Cells. J Immunol 2005;175(1):228-236.