Automated Sample Preparation Using Andrew+ Pipetting Robot for UPLC-MSE Identification and UPLC-MS/MS Quantification of Bovine Milk Proteins

Význam tématu

Proteiny kravského mléka jsou klíčové nejen z nutričního hlediska, ale i pro technologické vlastnosti potravinářských výrobků. Přesná identifikace a kvantifikace kaseinů a syrovátkových proteinů umožňuje kontrolu kvality mléčných produktů a vývoj alternativních proteinových zdrojů se srovnatelnými vlastnostmi.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout robustní workflow pro stanovení koncentrace pěti hlavních bílkovin kravského mléka (α-CN, β-CN, κ-CN, α-LA a β-LG) v tekutých vzorcích. Pro tento účel byly využity kroky: (1) tryptická digesce s pomocí ProteinWorks Auto-eXpress Digest Kit, (2) bottom-up proteomika k objevování unikátních peptidů, (3) kvantifikace pomocí UPLC-MS/MS v režimu MRM a (4) plně automatizované vzorkování Andrew+ Pipetting Robotem.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byla použita následující instrumentace a software:

• ProteinWorks Auto-eXpress Low Digest Kit s RapiGest SF surfaktantem
• Automatický pipetovací systém Andrew+ Pipetting Robot řízený cloudovým softwarem OneLab
• UPLC systém ACQUITY UPLC I-Class PLUS FTN se sloupcem Premier CSH C18 (2.1×100 mm, 1.7 µm)
• MS detektory Xevo G2-XS QTof pro MSE analýzu a Xevo TQ-S micro pro MRM kvantifikaci
• Software MassLynx v4.2, Progenesis QI for Proteomics v4.0, EZInfo v3.0 a TargetLynx v4.2

Hlavní výsledky a diskuse

Po tryptické digesci a UPLC-QTof-MSE analýze bylo identifikováno celkem 1050 peptidů s FDR pod 1 %. PCA analýza prokázala jasné oddělení pěti proteinových tříd a vnitřní kontrolní vzorky vykázaly vysokou reprodukovatelnost. Pomocí OPLS-DA a S-plotu byly vybrány signature marker peptidy pro každou bílkovinu. Pro kvantifikaci byly stanoveny MRM přechody s r2 > 0,99 na rozsahu koncentrací jednotlivých proteinů. Analýza pěti komerčních vzorků mléka potvrdila relativní zastoupení β-CN (41–49 %), α-CN (27–34 %), κ-CN (11–15 %), β-LG (10–12 %) a α-LA (3 %). Automatizace přípravy vzorků pomocí Andrew+ Pipetting Robota zkrátila pipetovací čas více než 5,5-násobně ve srovnání s manuální manipulací.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší následující výhody:

• Vyšší rychlost a úplnost tryptické digesce díky RapiGest SF
• Efektivní detekci fosfopeptidů s povrchovou technologií MaxPeak HPS
• Vysokou reprodukovatelnost a minimalizaci lidské chyby díky plné automatizaci
• Možnost přenosu workflow na analýzu alternativních proteinových zdrojů

Budoucí trendy a možnosti využití

Pro další rozvoj se doporučuje:

• Zařazení izotopově značených peptidů jako vnitřních standardů pro absolutní kvantifikaci
• Validace metodiky v různých komplexních matricích (rostlinné alternativy, fermentované produkty)
• Rozšíření automatizace na další kroky sample prep a datové zpracování
• Integrace do průmyslových QA/QC procesů a online monitoringu výroby

Závěr

Prezentovaný bottom-up proteomický přístup společně s plně automatizovanou přípravou vzorků nabízí robustní, rychlé a reprodukovatelné řešení pro identifikaci a kvantifikaci mléčných proteinů. Workflow je snadno přenositelné na nové proteiny a matricové systémy, což podporuje inovace v oblasti mlékárenské i rostlinné alternativy.

Reference

1. Lucey J, Otter D, Horne D. A 100-Year Review: Progress on The Chemistry of Milk and Its Components. J Dairy Sci. 2017;100:9916–9932.
2. McClements D, Newman E, McClements I. Plant-based Milks: A Review of the Science Underpinning Their Design, Fabrication, and Performance. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2019;18:2047–2067.
3. Tremblay L, Laporte M, Léonil J, Dupont D, Paquin P. Quantitation of Proteins in Milk and Milk Products. In: Fox P, McSweeney P, editors. Advanced Dairy Chemistry—1 Proteins. Springer; 2003. p. 49–138.
4. Song E, Gao Y, Wu C, et al. Targeted Proteomic Assays For Quantitation of Proteins Identified by Proteogenomic Analysis of Ovarian Cancer. Sci Data. 2017;1–13.
5. Bär C, Mathis D, Neuhaus P, et al. Protein Profile of Dairy Products: Simultaneous Quantification of Twenty Bovine Milk Proteins. Int Dairy J. 2019;97:167–175.