PROTEOLYTICKÉ ENZYMY: VÝZNAM PRO PROTEOMIKU

Význam tématu

Proteomika se zaměřuje na komplexní analýzu všech proteinů v buňkách, tkáních či organismech a jejich interakcí. Štěpení proteinů na peptidy proteolytickými enzymy je nezbytným krokem pro úspěšnou identifikaci pomocí hmotnostní spektrometrie. Výběr vhodného enzymu a optimalizace štěpení zásadně ovlivňují kvalitu a spolehlivost proteomických analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Článek shrnuje význam proteolytických enzymů v proteomice, popisuje jejich klasifikaci, mechanizmus katalýzy, hlavní používané enzymy, metody měření aktivity, predikci peptidových štěpů a variantní postupy proteolýzy v roztoku, gelu či na membránách. Dále dokumentuje úpravy enzymů pro zvýšení termostability a odolnosti vůči autolýze a naznačuje perspektivy pro vysokovýkonnou „shotgun“ proteomiku.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu proteinových vzorků se využívají:

• Dvousouřadnicová elektroforéza (2D)
• Kapalinová chromatografie (LC)
• MALDI-TOF/TOF a nanoESI-MS/MS, včetně kvadrupólových pastí a FT-ICR
• On-gel a on-membrane digesce aktivovaným trypsinem či jinými peptidami
• Mikroreaktory s imobilizovanými proteasami pro on-line štěpení

Hlavní výsledky a diskuse

Autorům se podařilo:

• Detailně popsat mechanismus katalýzy (např. triadový mechanizmus serinových peptidas a akyl-dis-akyl intermediáty)
• Klasifikovat proteolytické enzymy podle EC systému, zdrojů a typu aktivního místa (serinové, cysteinové, aspartátové, metaloproteasy, threoninové)
• Vyjmenovat klíčové endo- a exopeptidasy používané v proteomice (trypsin, chymotrypsin, Glu-C, Lys-C, Arg-C, Asp-N, termolysin, subtilisin, pronase, pepsin, karboxypeptidasy)
• Ilustrovat princip in silico predikce peptidových štěpů pro mapování molekulových hmotností a sekvenční tagy
• Porovnat výhody in-solution a in-gel digesce, on-membrane workflow a moderních mikroreaktorů
• Popsat modifikace enzymů (alkylace/acylace lysinových a argininových zbytků, derivatizace sacharidy, cyklodextrinové či polymerní konjugáty) pro zvýšení stability

Přínosy a praktické využití metody

Enzymatická proteolýza zkracuje čas a zjednodušuje přípravu vzorků, zajišťuje vysokou specificitu a reprodukovatelnost štěpení. Trypsin zůstává z důvodu definované specificity a optimálního pH nejpoužívanějším enzymem pro MS mapování a shotgun proteomiku. Kombinace různých peptidas umožňuje detailní analýzu posttranslačních modifikací a glykoproteomiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj top-down a bottom-up technik přinese vyšší hloubku proteomických analýz. Optimalizace proteolýzy v nevodných prostředích umožní lepší zpracování hydrofobních a membránových proteinů. Inženýrské varianty enzymů s vyšší termostabilitou a specifitou otevřou nové aplikace ve vysokovýkonné a klinické proteomice.

Závěr

Proteolytické enzymy představují pilíř moderní proteomiky. Jejich výběr, úpravy a postupy digesce významně ovlivňují kvalitu dat z hmotnostní spektrometrie. Další vývoj směřuje k rychlejší, spolehlivější a univerzálně použitelné proteolýze pro komplexní proteomické aplikace.

Reference

• Westermeier R., Naven T.: Proteomics in Practice. A Laboratory Manual To Proteome Analysis. Wiley-VCH, Weinheim 2002.
• Lamond A., Mann M.: Trends Cell Biol. 7, 139 (1997).
• Pandey A., Mann M.: Nature 405, 837 (2000).
• Havliš J., Thomas H., Šebela M., Shevchenko A.: Anal. Chem. 75, 1300 (2003).
• Washburn M. P., Wolters D., Yates J. R. 3rd: Nat. Biotechnol. 19, 242 (2001).
• Barrett A. J., v knize: Proteolytic Enzymes. A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford 2001.
• Rawlings N. D., Barrett A. J.: Nucleic Acids Res. 27, 325 (1999).
• Bienvenut W. V. et al.: Anal. Chem. 71, 4800 (1999).
• Wilm M. et al.: Nature 379, 466 (1996).
• Bark S. J. et al.: J. Am. Chem. Soc. 12, 1774 (2001).