VITATOX: Screeningová metoda pro simultánní stanovení kyseliny močové a alantoinu v krvi získané technikou suché kapky

Screeningová metoda pro simultánní stanovení kyseliny močové a alantoinu v krvi získané technikou suché kapky

Význam tématu
Volné radikály a reaktivní formy kyslíku představují významný faktor oxidačního stresu v lidském těle. Kyselina močová a její oxidační produkt alantoin jsou klíčovými markery antioxidační kapacity a oxidačního poškození. Spolehlivé, rychlé a snadno aplikovatelné analytické metody pro jejich stanovení mají širší uplatnění v klinické diagnostice, výzkumu a prevenci onemocnění souvisejících se stresem, kardiovaskulárními a metabolickými poruchami.
Cíle a přehled studie / článku

• Vyvinout a optimalizovat screeningovou LC–MS/MS metodu pro simultánní stanovení kyseliny močové a alantoinu v kapkách suché krve (DBS).
• Snížit objem odběru a zjednodušit přípravu vzorku oproti konvenčním metodám vyžadujícím velké objemy a komplexní extrakce.
• Ověřit analytické parametry, výtěžnost extrakce a kvalitu chromatografické separace.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: suché krevní kapky na filtračním papíře (Whatman 903), vyražení terčíku 6 mm (~10 µl krve).
• Extrakce: přidání interního standardu, extrakce ultrazvukem v mixu vody a acetonitrilu (optimalizace poměru 75–90 % ACN pro maximální výtěžnost).
• Chromatografie: LC-20 (Shimadzu), kolona Discovery HS-F5 (2,1×150 mm, 3 µm, 37 °C), isokratická eluce 10 % ACN/voda s 0,1 % kyseliny mravenčí, průtok 0,2 ml/min, doba analýzy 3 minuty.
• Detekce: LCMS-8045 (Shimadzu) v negativním režimu ESI (–3000 V), MRM přechody optimalizované pro oba analytické páry a jejich interní standardy.

Hlavní výsledky a diskuse

• Extrakční výtěžnost pro kyselinu močovou i alantoin dosahovala nad 80 % při optimálním poměru vody/ACN a ultrazvukové asistenci.
• Separace na HS-F5 kolóně poskytla ostré píky (<3 min) s vynikajícím poměrem signálu k šumu a bez významných matricových interferencí.
• Metoda umožňuje přesné kvantifikace v rozsahu referenčních koncentrací (UA 140–420 µmol/l, alantoin do 2 µmol/l) a prokázala reprodukovatelnost RSD <10 %.
• DBS přístup zkracuje přípravu vzorku, zvyšuje stabilitu analytů a snižuje logistické nároky pro klinické aplikace.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální objem krve a neinvazivní odběr vhodný pro screening novorozenců, ambulantní i terénní sběr.
• Automatizovatelnost a rychlost analýzy (3 min) vedou k vyšší průchodnosti vzorků v rutinních laboratořích.
• Simultánní stanovení poskytuje komplexní pohled na antioxidační stav pacienta a indikátory oxidačního stresu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Validace metody vůči referenčním postupům (urikasová metoda, GC–MS) a akreditace pro klinické laboratoře.
• Aplikace ve velkých epidemiologických studiích a monitorech oxidačního stresu.
• Adaptace na další biomarkery oxidativního poškození, rozšíření panelu o lipidové a nukleové produkty oxidace.

Závěr
Navržená metoda kombinující DBS sampling a rychlou LC–MS/MS analýzu představuje efektivní nástroj pro simultánní stanovení kyseliny močové a alantoinu s mnohočetnými výhodami oproti tradičním postupům. Její implementace v klinických a výzkumných laboratořích prohlubuje možnosti monitoringu oxidačního stresu a antioxidační ochrany.
Reference

1. Ren X. Bioanalysis 2010, 2: 1469-1475.
2. Wagner M. Mass Spectrom Rev 2016, 35: 361-438.