Simple Method Optimization in mAb Charge Variant Analysis using pH Gradients Generated from Buffer Advisor with Online pH and Conductivity Monitoring

Význam tématu

Iontově výměnná chromatografie je klíčová pro detailní charakterizaci nábojových variant proteinů.
Monoklonální protilátky často podléhají posttranslačním modifikacím ovlivňujícím jejich povrchový náboj.
Optimalizace pH gradientů zvyšuje rozlišení a snižuje zatížení chromatografického systému oproti přímé solné eluci.

Cíle a přehled studie

Studie ukazuje vývoj metody pro profilování nábojových variant monoklonálních protilátek pomocí lineárních pH gradientů vypočítaných v Agilent Buffer Advisor Software.
Porovnává výkonnost pH gradientů a tradičních solných gradientů a prezentuje online monitorování pH a vodivosti během optimalizace.

Použitá metodika

Lineární pH gradienty byly vypočítány v rozsahu pH 6,0–7,8 (pro Anti-DYKDDDDK) a pH 6,0–7,6 (pro Anti-c-Myc).
Chromatografie probíhala na kolonce Bio MAb PEEK (4,6×250 mm, 5 μm) s mobilní fází na bázi NaCl a fosfátových pufrů.
Parametry zahrnovaly průtok 1 mL/min, teplotu vzorku 6 °C a detekci DAD při 280 nm.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary Pump (G5611A)
• Agilent 1260 Infinity High performance Bio-inert Autosampler (G5667A)
• Agilent 1290 Infinity Thermostat (G1330B)
• Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment (G1316C)
• Agilent 1260 Infinity DAD (G1315C) s bio-inert průtokovou kyvetou
• Monitor pH/C-900 od GE Healthcare s online připojením
• Agilent OpenLAB CDS ChemStation Edition, Rev. C.01.05

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované pH gradienty dosáhly výrazně vyššího rozlišení než solné gradienty 10–100 mM NaCl.
Pro mAb Anti-DYKDDDDK byl optimální rozsah pH 6,4–7,0, pro mAb Anti-c-Myc pH 6,4–7,6.
Online měření pH a vodivosti potvrdilo správnost výpočtů Buffer Advisor a stabilitu analytického systému.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší rozlišení nábojových variant umožňuje přesnou kvantifikaci a charakterizaci proteinů.
• Snížená koncentrace soli minimalizuje opotřebení analytické aparatury a usnadňuje následné úpravy vzorku.
• Rychlá optimalizace metod pomocí softwarových výpočtů zkracuje čas vývoje.
• Online monitorování zabezpečuje validaci pH a vodivosti v reálném čase.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace pH gradientů s dalšími detektory (MS, kapilární elektroforéza) pro komplexní proteomiku.
Rozšíření softwarové podpory pro automatizovanou optimalizaci gradientů a validaci metod.
Aplikace v rutiní kontrole kvality biopharmaceutik a validaci výrobních procesů.

Závěr

Kombinace Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC systému a Buffer Advisor Software umožňuje efektivní vývoj metod s vysokým rozlišením nábojových variant mAb.
Online monitorování zajišťuje spolehlivost měření a usnadňuje přechod metody do rutinního provozu.

Reference

• Ahamed T., et al. pH-gradient ion exchange chromatography: An analytical tool for design and optimization of protein separations. Journal of Chromatography A 1164 (2007): 181-188.
• Farnan D., Moreno G.T. Multiproduct High-Resolution Monoclonal Antibody Charge Variant Separations by pH Gradient Ion-Exchange Chromatography. Analytical Chemistry 81 (2009): 8846–8857.
• Protein Separation with pH Gradients Using Composite Buffer Systems Calculated by the Agilent Buffer Advisor Software. Application Note, Agilent 5991-1408EN (2012).
• Online pH and Conductivity Measurement with an Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC System and a GE Monitor pH/C-900. Technical Overview, Agilent 5991-2354EN (2013).