N-linked Glycan Characterization and Profiling: Combining the Power of Accurate Mass, Reference Glucose Units, and UNIFI Software for Confident Glycan Assignments

Význam tématu

Charakterizace N-vázaných glykosidických řetězců (glykánů) je zásadní pro vývoj a výrobu bioterapeutik, protože ovlivňuje jejich stabilitu, farmakokinetiku a imunitní odpověď. Spolehlivá a reprodukovatelná metoda pro profilování glykánů podporuje kvalitu, srovnatelnost šarží a bezpečnost bioléčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat nový workflow pro uvolněné 2-AB značené N-glykany využívající online chromatografii UPLC-FLR spárovanou s QTof MS a databází Waters Glycan GU Library v prostředí UNIFI. Praktická aplikace zahrnovala komparativní studii glykánových profilů inovátoru etanerceptu a jeho biosimilárního kandidáta.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a detekci glykánů byla použita kombinace:

• UPLC: ACQUITY UPLC H-Class Bio System s kolónou Glycan BEH Amide (130Å, 1,7 µm).
• Detekce: FLR detektor v přímé linii s Xevo G2-S QTof MS (ESI+).
• Software: UNIFI Scientific Information System verze ≥ 1.7 s integrovanou Waters Glycan GU Library.
• Příprava vzorku: GlycoWorks Reductive Amination Single Use Kit pro 2-AB značení a 2-AB Dextran Calibration Ladder pro kalibraci retenčních časů v GU.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila automatizované zarovnání FLR a MS chromatogramů, výpočet retenčních časů v glukózových jednotkách (GU) a vyhledání odpovídajících struktur v databázi. Přesnost detekce byla podpořena kombinací GU a přesné hmotnosti. Při srovnání etanerceptu a jeho biosimiláru byly u biosimiláru zaznamenány vyšší podíly high-mannózových forem (Man6, Man8) a několik nízce zastoupených sialylovaných glykánů (> 0,1 %), které v inovátoru chyběly.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný workflow zkracuje dobu analýzy a minimalizuje ruční zásahy, čímž zvyšuje reprodukovatelnost a integritu dat. Integrované reporty v UNIFI umožňují rychle sdílet výsledky jednotlivých vzorků či komparabilních studií bez nutnosti exportu do externích balíčků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat včetně rozsáhlejších GU knihoven, integrace DDA MS/MS pro potvrzení izomerů a automatizovaných exoglykozidázových panelů. Vznikají také příležitosti pro validované GMP workflow a rozšíření aplikací do oblasti glykoproteinových biomarkerů.

Závěr

Popsaný Glycan Application Solution s UPLC-FLR/MS a UNIFI poskytuje rychlý, přesný a vysoce reprodukovatelný postup pro charakterizaci N-vázaných glykánů. Metoda podporuje jak rutinní QC analýzy, tak komplexní komparabilní studie bioterapeutik.

Reference

• Yu YQ. N-linked Glycan Characterization and Profiling: Combining the Power of Accurate Mass, Reference Glucose Units, and UNIFI Software. Waters Corporation, Application Note 720004845EN, 2016.