Combining RapiFluor-MS and UNIFI Scientific Information System for a Total N-linked Glycan Solution for Innovator vs. Biosimilar Infliximab Comparisons

Význam tématu

Glykosylace monoklonálních protilátek představuje klíčový kvalitativní atribut ovlivňující farmakokinetiku a farmakodynamiku terapeutických bílkovin. U biosimilárních produktů je nezbytné prokázat, že profil N-vázaných glykánů odpovídá originálnímu léku, protože odlišnosti ve fukosylaci nebo sialylaci mohou měnit účinnost a imunogenní vlastnosti.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat kompletní řešení pro analýzu N-vázaných glykánů inovátorské a biosimilární verze infliximabu. Platforma zahrnuje:

• chemii vzorku (uvolnění a značení glykánů pomocí GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit),
• analytickou část (ACQUITY UPLC H-Class Bio System s FLR detektorem a Xevo G2-XS QTof MS),
• datové zpracování a interpretaci (UNIFI Software s Glycan Application Solution a GU knihovnou).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky tří šarží inovátorského infliximabu (Remicade®) a jedné šarže biosimiláru (Inflectra®) byly denaturovány, enzymaticky ošetřeny PNGase F, a uvolněné glykany derivatizovány RapiFluor-MS činidlem. Očištěné glykany procházely HILIC separací na kolóně BEH Amide při 60 °C s gradientem amonné formiát–acetonitril. Detekce probíhala pomocí FLR (Ex 265 nm/Em 425 nm) a přesného hmotnostního analyzátoru QTof. Data sbíral a zpracovával UNIFI Scientific Information System využívající GU kalibraci vůči RFMS značené dextranové žebříku a knihovnu struktur glykánů.

Hlavní výsledky a diskuse

Obě formy infliximabu vykázaly velmi podobné profily glykánů. Celkem bylo u originálního léku identifikováno 23 hmotnostně potvrzených forem a u biosimiláru 22. Rozdílové grafy FLR signálu ukázaly:

• hlavní glykan F(6)A2 se srovnatelnou abundancí,
• lehkou zvýšenou hladinu glykanů s α-galaktózou (např. F(6)A2G(3)1) u biosimiláru,
• mírný nárůst nízkootpočtových glykánů zakončených N-glykolylneuraminovou kyselinou u biosimiláru.

Významnou roli sehrálo použití GU normalizace pro zvládnutí variability retence HILIC kolony a library search s tolerancí ΔGU ±0,2.

Přínosy a praktické využití metody

Celé řešení zkracuje přípravu vzorku pod jednu hodinu, zvyšuje citlivost a spolehlivost detekce díky RFMS značení a automatizuje interpretaci výsledků. Široce využitelné nástroje UNIFI usnadňují porovnání profilů, generování reportů a integraci do vývojových či QA/QC procesů v biotechnologickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dokončení a rozšíření GU knihovny RFMS značených glykánů pro pokrytí širšího spektra bioterapeutik.
• Implementace metodiky do rutinní kontroly kvality a regulatorních dokumentací pro biosimilární produkty.
• Rozšíření workflow na O- a C-glykany či na komplexní glykoprofilování dalších biologických molekul.

Závěr

Představené komplexní řešení umožňuje rychlou, citlivou a reprodukovatelnou analýzu N-vázaných glykánů včetně srovnání originálního a biosimilárního infliximabu. Díky integraci pokročilé chemie vzorku, UPLC-MS a sofistikovaného softwaru je možné efektivně monitorovat kritické kvalitativní atributy v biotechnologickém vývoji a produkci.

Reference

1. Shields RL a kol. Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity. J Biol Chem. 2002;277:26733–26740.
2. Lauber MA a kol. Rapid preparation of released N-glycans for HILIC analysis using a labeling reagent that facilitates sensitive fluorescence and ESI-MS detection. Anal Chem. 2015;87:5401–5409.
3. Guile GR a kol. A rapid high-resolution high-performance liquid chromatographic method for separating glycan mixtures and analyzing oligosaccharide profiles. Anal Biochem. 1996;240:210–226.
4. Yu YQ. N-linked Glycan Characterization and Profiling: Combining the Power of Accurate Mass, Reference Glucose Units, and UNIFI Software for Confident Glycan Assignments. Waters Application Note. 2013.
5. GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit – 96 Sample Care and Use Manual. Waters User Manual. 2016.
6. Campbell MP a kol. GlycoBase and autoGU: tools for HPLC-based glycan analysis. Bioinformatics. 2008;24:1214–1216.
7. Jung SK a kol. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 2014;6:1163–1177.