Development of a Quantitative SPE LC-MS/MS Assay for Bradykinin in Human Plasma

Význam tématu

Bradykinin je devítaminokyselinový peptid s klíčovou rolí v regulaci krevního tlaku, propustnosti cév a zánětlivých procesech. Přesné stanovení jeho koncentrace v plazmě je náročné vzhledem k jeho nízkým hladinám, rychlému metabolismu a tvorbě během odběru. Moderní kvantitativní metody LC-MS/MS nabízí vyšší selektivitu, přesnost a kratší dobu vývoje oproti tradičním ligandovým testům.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a validovat rychlou a citlivou kvantitativní metodu pro stanovení bradykininu v lidské plazmě pomocí tuhých fází SPE a UPLC-MS/MS. Studie se zaměřila na optimalizaci odběru krve, přípravy vzorku, extrakce, chromatografické separace a detekce za účelem dosažení nízké meze detekce a spolehlivých výsledků v rozsahu 5–10 000 pg/mL.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly odebírány do EDTA-tubusů s proteázovými inhibitory k zamezení ex vivo tvorby bradykininu. Přidaním interního standardu [Lys-des-Arg9]-bradykininu byly vzorky předúpraveny roztokem 5 % NH4OH. Extrakce proběhla na 96-well Oasis WCX µElution desce: kondicionování MeOH a zásaditou vodou, naložení, dvojité mytí se zředěným roztokem NH4OH a 10 % acetonitrilem a eluace 1 % TFA v acetonitril-vodním elučním roztoku. Chromatografie byla provedena na CORTECS UPLC C18 (2,1×50 mm, 1,6 µm) s gradientem formátovaným formiátem (0,1 % formiové kyseliny ve vodě/acetonitrilu) a tokem 0,4 mL/min, celková doba běhu 3,5 minuty. Detekce MRM na Xevo TQ-S MS ve pozitivním ESI režimu sledovala 3+ ionty bradykininu (m/z 354→419, m/z 354→408) a interního standardu (m/z 344,94→386,03).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace pre-treatmentu hydroxidem amonným zlepšila výtěžnost z ~80 % na 100 %. Peak width dosahovaly 2,5–3 s oproti 4 s na plně pórových částicích. Metoda vykázala lineární odezvu od 5 do 10 000 pg/mL (R²>0,99). QC vzorky (25, 80, 250, 800, 5 000 pg/mL) splnily FDA kritéria přesnosti (99,8–106,8 %) a přesnosti (%CV <6 %). Matricové efekty byly nižší než 10 %. Klíčové bylo použití proteázových inhibitorů při odběru, bez nichž se koncentrace bradykininu uměle zvyšují až o několik set pg/mL.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• rychlou analýzu za 3,5 minuty,
• citlivou detekci až 5 pg/mL z 200 µL plazmy,
• vysokou selektivitu díky SPE a specifickým MRM přechodům,
• minimální ztráty peptidu díky µElution formátu SPE,
• multiplexní analýzu peptidů v bioanalytických studiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření LC-MS/MS metod pro další biologické peptidy a proteiny.
• Automatizované řešení pro vysokopropustné PK/PD studie.
• Klinické monitorování terapie a diagnostiku zánětlivých či kardiovaskulárních onemocnění.
• Standardizace postupů a validace pro regulované laboratoře.

Závěr

Popsaná metoda představuje robustní, rychlý a vysoce citlivý analytický protokol pro kvantifikaci bradykininu v lidské plazmě. Díky optimalizované pre-analytické přípravě, mixed-mode SPE a CORTECS UPLC C18 kolonce lze spolehlivě měřit nízké hladiny bradykininu v klinických i výzkumných aplikacích.

Použitá instrumentace

• Waters ACQUITY UPLC System
• CORTECS UPLC C18 Column, 2,1×50 mm, 1,6 µm
• Xevo TQ-S Mass Spectrometer
• Oasis WCX 96-well µElution Plate
• Waters ACQUITY Collection Plate

Reference

1. Murphey LJ, Hachey DL, Oates JA, Morrow JD, Brown NJ. Metabolism of Bradykinin In Vivo in Humans: Identification of BK1-5 as a Stable Plasma Peptide Metabolite. J Pharmacol Exp Ther. 2000;294:263-269.
2. Wagner BM, Schuster SA, Boyes BE, Kirkland JJ. Superficially porous silica particles with wide pores for biomacromolecular separations. J Chromatogr A. 2012;1264:22-30.
3. Kirkland JJ, Schuster SA, Johnson WL, Boyes BE. Fused-Core Particle Technology in High-Performance Liquid Chromatography; An Overview. J Pharm Anal.
4. Viswanathan CT et al. Quantitative bioanalytical methods validation and implementation: best practices for chromatographic and ligand binding assays. Pharm Res. 2007;24:1962-1973.
5. Bansal S, DeStefano A. Key elements of bioanalytical method validation for small molecules. AAPS J. 2007;9:E109-E114.
6. Cugno M et al. Plasma bradykinin levels in human chronic congestive heart failure. J Clin Sci (Lond). 2000;99:461-466.
7. Nussberger J et al. Plasma bradykinin in angio-oedema. Lancet. 1998;351:1693-1697.