An Improved SPE-LC-MS/MS Method for the Quantification of Bradykinin in Human Plasma Using the ionKey/MS System

Význam tématu

Citlivá a selektivní kvantifikace peptidu bradykininu v lidské plasmě je zásadní pro výzkum klinických biomarkerů. Bradykinin se v plazmě vyskytuje v nízkých pg/mL hladinách, je rychle metabolizován a zároveň se může při odběru a zpracování vzorků vznikat ex vivo enzymatickými reakcemi. Robustní metoda je proto klíčová pro spolehlivá data v preklinickém i klinickém hodnocení.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout vylepšenou metodiku SPE-LC-MS/MS pro kvantifikaci bradykininu v lidské plasmě s využitím systému ionKey/MS. Snahou bylo snížit objem vzorku a rozpouštědel, zvýšit citlivost, zkrátit dobu přípravy a minimalizovat nežádoucí vznik bradykininu ex vivo.

Použitá metodika a instrumentace

Pro odběr plazmy byly použity krevní odběrové zkumavky BD™ P100, P700, P800 s proteázovými inhibitory a kontrolní zkumavky s K2EDTA. Extrakce byla prováděna na Oasis® WCX 96-well μElution Plate metodou mixed-mode SPE (ion-exchange a RP). Chromatografii zajišťoval ACQUITY UPLC® M-Class System s 2D technologiemi (trap/back-flush) a iKey™ Separation Device BEH C18 (150 μm I.D. × 50 mm, 1.7 μm, 300 Å). Ionizace probíhala v ionKey™ Source propojeném se systémem ionKey/MS na hmotovém spektrometru Xevo TQ-S. Řízení a kvantifikaci provádělo softwarové prostředí MassLynx™ 4.1 a TargetLynx™.

Hlavní výsledky a diskuse

• LLOQ 2,5 pg/mL bradykininu při 100 μL plazmy, lineárnost 2,5–8000 pg/mL (R2>0,99).
• Přesnost 92,7–104,0 % a precize (CV) 1,2–4,3 % splňující FDA kritéria.
• Snížení objemu plazmy o 2× a nárůst citlivosti signál/šum 7–10× versus analytické 2,1 mm I.D. LC.
• Spotřeba organických rozpouštědel redukována 50×, čas extrakce <30 minut.
• Použití vysokom/z fragmentů b/y >200 zvyšuje selektivitu a snižuje pozadí matrice.
• Výrazný vliv odběrových zkumavek: P100 0,186 ng/mL endogenního bradykininu, P700 0,0945 ng/mL, bez inhibitorů po 1 cyklu mrazení až 0,81 ng/mL a po 4 dnech skladování 5,49 ng/mL.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší citlivost umožňuje detekci nízkých pg/mL hladin s malým objemem vzorku (100 μL).
• Nižší náklady díky snížené spotřebě rozpouštědel a opakovaným injekcím pro ISR.
• Rychlá a automatizovatelná SPE v 96-well formátu pro vysokou propustnost.
• Metoda je vhodná pro PK/PD a klinické studie vyžadující spolehlivé měření peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace ionKey/MS na multiplexní analýzu dalších peptidů a malých proteinů.
• Integrace s automatizovanými proteomickými workflow pro vysokoprocesní screening.
• Další miniaturizace a optimalizace spotřeby vzorku pro vzácné matrix.
• Vývoj jednotných odběrových systémů s cílenými inhibitory pro různé peptidy.

Závěr

Optimalizovaná metoda využívající mixed-mode SPE, mikroproudovou chromatografii ionKey/MS a specifické MRM přechody dosahuje mimořádné citlivosti, přesnosti a robustnosti pro kvantifikaci bradykininu v lidské plasmě. Klíčová je správná předanalytická stabilizace a volba inhibitorů v odběrových zkumavkách.

Reference

1. Lame ME, Chambers EE, Fountain KJ. Development of a Quantitative SPE LC-MS/MS Assay for Bradykinin in Human Plasma. Waters Application Note 720004833EN, 2013.
2. Murphey LJ et al. Metabolism of Bradykinin In Vivo in Humans: Identification of BK1-5 as a Stable Plasma Peptide Metabolite. J Pharmacol Exp Ther. 2000;294:263–269.
3. Viswanathan CT et al. Quantitative bioanalytical methods validation and implementation: best practices for chromatographic and ligand binding assays. Pharm Res. 2007;24:1962–1973.
4. Bansal S, DeStefano A. Key elements of bioanalytical method validation for small molecules. AAPS J. 2007;9:E109–114.
5. Cugno M et al. Plasma bradykinin levels in human chronic congestive heart failure. J Clin Sci (Lond). 2000;99(5):461–469.
6. Nussberger J et al. Plasma bradykinin in angio-oedema. Lancet. 1998;351(9117):1693–1697.
7. Molecular Diagnostics and Proteomics Blood Collection Systems. BD Diagnostics Corporation, 2016.