Advanced HPLC Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Macromolecular Proteins Using 3.5 μm Ethylene Bridged Hybrid (BEH) Particles

Význam tématu

Size‐exclusion chromatografie (SEC) je zásadní pro analýzu a kontrolu kvality proteinů v biotechnologii a farmaceutickém průmyslu. Precizní stanovení velikostního profilu makromolekulárních proteinů umožňuje identifikovat agregáty, monomery a další formy, které ovlivňují účinnost, bezpečnost a stabilitu bioléčiv. Moderní materiály výplně sloupce s vysokou stabilitou a jemnou distribucí částic zvyšují rozlišovací schopnost a zkracují analýzu, což významně zefektivňuje řízení výrobních a QC procesů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo představit novou řadu HPLC‐kompatibilních SEC sloupců XBridge Protein BEH SEC s částicemi 3,5 μm a pórovitostí 200 Å a 450 Å. Autoři zkoumali:

• rozlišení makromolekulárních proteinů oproti tradičním silikaovým SEC sloupcům s většími částicemi,
• vliv menší velikosti částic na citlivost a šířku píků,
• mechanickou stabilitu a toleranci vyššího tlaku
• opakovatelnou výrobu a životnost sloupců v alkalických pH.

Použitá metodika a instrumentace

Analýzy proběhly na systémech Waters Alliance HPLC a ACQUITY UPLC H-Class Bio System při izokratickém eluačním režimu. Jako mobilní fáze sloužila směs 25 mM fosfátového pufru se 150 mM NaCl, pH 7,2 připravená pomocí Auto•Blend Plus™ technologie. Detekce byla prováděna UV lampou (TUV detector) při 214 a 280 nm. Vzorky proteinových standardů (thyroglobulin, IgG, BSA, myoglobin, uracil) byly připraveny při koncentraci 1 mg/ml a aplikovány objemem 10 µl. Data se sbírala a zpracovávala v softwaru Empower Pro v.2 a v.3.
Instrumentace:

• Alliance HPLC System
• ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• Alliance a ACQUITY UPLC TUV detektory
• Sloupce XBridge Protein BEH SEC 200Å a 450Å 3,5 μm (7,8 × 150 a 7,8 × 300 mm)
• Mobilní fáze: 25 mM Na‐fosfát, 150 mM NaCl, pH 7,2
• Empower Pro pro řízení a analýzu dat

Hlavní výsledky a diskuse

Kontrast s 5 μm silikaovými sloupci prokázal, že BEH 3,5 μm částice přináší zúžené píky a zlepšené rozlišení až o 40 % pro oddělení IgG monomeru a dimeru. Ve verzi 450 Å byla zlepšení až 75 % díky většímu poklesu velikosti částic. Mechanická pevnost BEH materiálu umožnila dvojnásobné zvýšení průtoku (z 1,0 na 2,0 ml/min) bez poškození sloupce, přičemž zkrácení doby analýzy bylo úměrné snížení rozlišení pouze o ~25 %. Tolerance pH 7,2 a robustnost povrchové chemie diolových vazeb zajistily životnost nad 600 injekcí s minimální driftou retenčních časů (SD ≤ 0,08 min).

Kalibrace retenčních objemů ukázala lineární rozsahy:

• 200 Å sloupec: 10 – 450 kDa
• 450 Å sloupec: 50 kDa – 1,3 MDa (částečné rozlišení až 1,8 MDa)

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší rozlišení agregátů proteinů bez zdvojování délky sloupce
• Možnost optimalizovat throughput při zachování dostatečné kvality separace
• Vysoká reprodukovatelnost mezi sloupci a mezi výrobními šaržemi
• Široké molekulové hmotnostní spektrum pro QC bioléčiv i výzkumné aplikace
• Jednoduchý přechod mezi HPLC a UPLC formáty založený na stejném BEH materiálu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj částic BEH s variabilní pórovitostí a modifikacemi povrchu pro cílené separace proteinových komplexů a konjugátů. Propojení s hyphenovanými systémy (MALS, ICP, MS) nabídne detailní charakterizaci molekulárních forem. Vývoj UPLC‐kompatibilních formátů o menším ID a rychlejších systémech utlumí limit extra‐column rozptýlení a umožní vysokopropustné biofarmaceutické workflow.

Závěr

SEC sloupce XBridge Protein BEH SEC 200 Å a 450 Å s částicemi 3,5 μm kombinují vynikající rozlišení, mechanickou odolnost a chemickou stabilitu. Přinášejí významné zrychlení analýzy, bez nutnosti kompromisu v kvalitě separace, a poskytují spolehlivou platformu pro rutinní kontrolu makromolekulárních proteinů.

Reference

1. Fountain KJ et al. Analysis of Biomolecules by Size‐Exclusion UltraPerformance Liquid Chromatography. Waters Corp. Application Note 2010.
2. Hong P, Koza S, Fountain KJ. Advances in Size‐Exclusion Chromatography for Peptides and Proteins. Waters Corp. Application Note 2012.
3. Koza S, Lauber M, Fountain KJ. Analysis of Multimeric Monoclonal Antibody Aggregates. Waters Corp. Application Note 2013.
4. Koza S, Fountain KJ. Transfer of Size‐Exclusion Separations between HPLC and UPLC. Waters Corp. Application Note 2014.