High-throughput Mass Spectrometry Analysis of Synthetic Oligonucleotides

Význam tématu

Analytika syntetických oligonukleotidů je klíčová pro kvalitní vývoj a výrobu DNA/RNA produktů používaných ve výzkumu i terapeutických aplikacích. Kombinace kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie umožňuje detailní charakterizaci sekvence, čistoty a postsyntetizačních modifikací. S rostoucí poptávkou po kratších analýzách ve vysokém objemu je nutné vyvážit rychlost analýzy oproti separační schopnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo porovnat dvě vysoce propustné metody pro desalthování a analýzu oligonukleotidů – Fast LC a RapidFire. Obě metody byly optimalizovány na 18meru a následně testovány pro řadu oligonukleotidů o délce 18–100 nukleotidů. Hodnoceny byly parametry throughput, efektivita odstraňování solí, reprodukovatelnost a schopnost detekce nízkoabundantních nečistot.

Použitá metodika a instrumentace

Rychlý LC přístup využíval Agilent 1290 Infinity II s duálními jehlami a vysokým průtokem (1,75 mL/min) přes malý guard column spojený přímo s Agilent 6545 LC/Q-TOF. Rychlost snímání byla 10 spekter/s, gradient trval jen 0,6 minuty. RapidFire metoda byla postavena na systému Agilent RapidFire 400 s PLRP-S kazetou (4 μL), kdy každá vzorka procházela 6 s desalthováním a 6 s eluční fází při průtocích 1,2 mL/min (Pump 1) a 0,6 mL/min (Pumps 2 a 3). Detekce probíhala opět na Agilent 6545 LC/Q-TOF, 4 spektra/s. Analýza dat byla zajištěna software MassHunter Bioconfirm B07.

Hlavní výsledky a diskuse

• Throughput: RapidFire dosáhl ~15 s na vzorek (240 vzorků/h), Fast LC ~40 s na vzorek (90 vzorků/h).
• Reprodukovatelnost průtoků a retention times byla u obou metod vynikající, RapidFire ukázal rovnoměrné tlakové profily v rozmezí 0,5–10 MPa.
• Efektivita desalthování: RapidFire snížil solné addukty 2–3× více než Fast LC u všech délek oligonukleotidů (18–100mer).
• Intenzita signálu: Fast LC vykázal nižší intenzitu větších oligonukleotidů (jen 25–80 % signálu oproti RapidFire) z důvodu vyššího průtoku a kratšího kontaktu s ionizátorem.
• Separace: RapidFire eluce probíhá tvoření jedné společné špičky bez diferenciace délek. Fast LC umožnil rozlišení 18 a 20meru a poskytl variabilní retenční časy v rámci 7s okna pro délky 18–100mer.
• Detekce nízkoabundantních nečistot: RapidFire rozlišil v dekonvoluovaných spektrách parazitní produkty s relatívními oblastmi již od ~0,5 %, včetně truncací, aduktů sodíku a draslíku či depurinací.

Přínosy a praktické využití metody

• RapidFire přináší výrazné zrychlení vzorkopisu a efektivní desalthování bez nutnosti chromatografické separace, vhodné pro rychlý screening a kvalitativní QC.
• Fast LC umožňuje částečnou separaci blízkých oligonukleotidů a redukci iontového potlačení, což je výhodné při analýze směsí s podobnými délkami.
• Obě metody poradí s detekcí nízkoabundantních nečistot, což podporuje spolehlivé hodnocení čistoty syntetických oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace s robotickými systémy a automatizace předanalytických kroků pro zvýšení throughput.
• Optimalizace gradientů a parametrů průtoku pro cílené vyvážení mezi separací a rychlostí podle konkrétní aplikace.
• Vyšší citlivost díky novým ionizačním zdrojům a rychlejším detektorům umožní analýzu stále delších a modifikovaných oligonukleotidů.
• Pokročilá softwarová řešení pro dekonvoluci a kvantifikaci nízkoabundantních produktů v komplexních směsích.

Závěr

Both RapidFire a Fast LC metody poskytují spolehlivá a vysoce propustná řešení pro analýzu syntetických oligonukleotidů. RapidFire vyniká rychlostí a účinným odstraňováním solí, zatímco Fast LC nabízí lepší separaci blízkých produktů. Volba metody závisí na požadavcích na throughput versus potřebu rozlišení jednotlivých délek a komplexity vzorku.

Reference

• Agilent Technologies, Inc. Application Note 5994-3753EN, July 2021, DE44376.4982060185