High-throughput Analysis of DNA-Modifying Enzymes by an Agilent RapidFire System

Význam tématu

Enzymy modifikující DNA jsou klíčovými cíli při vývoji protinádorových léčiv. Vznik potřebných analytických metod pro studium epigenetických změn a oprav DNA urychluje objev nových inhibitorů. Vysoce propustné, spolehlivé a bezštítkové assay umožňují rychlejší screenování a přesnější vyhodnocení aktivity enzymů.

Cíle a přehled studie / článku

Tento článek představuje využití systému Agilent RapidFire kombinujícího mikrofluidní SPE s TOF-MS pro analýzu enzymů působících na DNA. Demonstruje detekci nativních DNA substrátů a produktů, časový průběh reakcí rodiny AlkB a měření cytosinových methylací pomocí SssI MTázy, včetně skríningu inhibitorů.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický systém RapidFire spojuje on-line extrakci pevnou fází s TOF-MS detekcí. Průměrný cyklus na vzorek je cca 8 s, umožňující analýzu přes 10000 vzorků denně ve formátech 96 a 384 jamkových destiček. Detekce probíhá bez štítků, přímým měřením nativních DNA molekul.

Hlavní výsledky a diskuse

Ultrakvantifikace reakčních mezistupňů a produktů reakce AlkB na ethenoadenin (εA) odhalila epoxidové a glykolové meziprodukty před tvorbou finální adeninu. Měření cytosinových methylací modelové 24-mer duplexní DNA ukázalo rozložení až osmi různě methylovaných forem s dominancí pětiknásobné methylace. Stanovení konverzního profilu a linearity reakce bylo dosaženo součtem produktů 1–6-násobné methylace. Inhibitor SAH vykázal IC50 kolem 14 µM. Skríning 384 bioaktivních látek odhalil několik substituovaných chinolonů jako potenciální MTasa inhibitory.

Přínosy a praktické využití metody

• Bezštítková přímá detekce nativních DNA molekul minimalizuje artefakty
• Současné měření substrátů, meziproduktů i produktů zvyšuje detailnost dat
• Vysoká propustnost (8 s/vzorek) urychluje rozsáhlé screeny
• Simplifikace assay vývoje bez potřeby specifických protilátek či syntéz substrátů

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací na další DNA a RNA modifikační enzymy, plná automatizace skríningu a integrace s pokročilou analýzou dat. Metoda podporuje personalizovaný přístup v epigenetickém výzkumu a farmakologii.

Závěr

Agilent RapidFire s TOF-MS nabízí vysoce propustnou, přímou a multiplexní analýzu DNA-modifikačních enzymů. Metoda zkracuje čas vývoje testů, zvyšuje kvalitu dat a podporuje objevování nových inhibitorů relevantních pro onkologickou terapii.

Reference

1. Kelley MR, Fishel ML. DNA Repair Proteins as Molecular Targets for Cancer Therapeutics. Anticancer Agents Med Chem. 2008;8(4):417–425.
2. Mishra MV et al. DNMT1 as a Molecular Target in a Multimodality-Resistant Phenotype in Tumor Cells. Mol Cancer Res. 2008;6(2):243–249.
3. Koike K et al. Anti-Tumor Effect of AlkB homolog 3 Knockdown in Hormone-Independent Prostate Cancer Cells. Curr Cancer Drug Targets. 2012;12(7):847–856.
4. Pan Z et al. Impaired Placental Trophoblast Lineage Differentiation in Alkbh1(-/-) Mice. Dev Dyn. 2008;237(2):316–327.
5. Delaney JC et al. AlkB Reverses Etheno DNA Lesions Caused by Lipid Oxidation in vitro and in vivo. Nat Struct Mol Biol. 2005;12(10):855–860.
6. Phiasivongsa P et al. Quinoline Derivatives for Modulating DNA Methylation. Patent application number: 20110256092. 2011.