Performance Comparison to Determine LC Method Compatibility

Význam tématu

Metodická kompatibilita a robustnost kapalinové chromatografie je nezbytná pro spolehlivou analýzu malých i biomolekulárních vzorků. S rostoucím využitím vysoce solných pufrů a agresivních čistících roztoků v bioaplikacích je klíčové disponovat přístroji, které nabídnou stabilní výkon, přesné míchání mobilní fáze a odolnost vůči kontaminaci železem.

Cíle a přehled studie

Technická studie porovnává Agilent 1260 Infinity II Prime LC System (nerezová ocel) a Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC System (železo-volný, biokompatibilní) ve třech aplikačních režimech: isokratickém, rychlém gradientním a mělkém gradientním. Cílem je ověřit přesnost míchání, opakovatelnost retencí a přenositelnost metod mezi systémy.

Použitá metodika a instrumentace

Metody:

• Isokratická analýza jednoduchého testovacího vzorku (65 % organické fáze).
• Rychlý gradient (5 minut, 20–90 % organické fáze) s RRLC směsí.
• Mělký gradient (20–38,5 % organické fáze během 52 minut) separace triterpenoidního extraktu Ganoderma lucidum.

Použitá instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC System: 800bar kvaternární pumpa, multisampler s termostatem, multikolónový termostat, DAD detektor s biokompatibilní buňkou (10 mm).
• Agilent 1260 Infinity II Prime LC System: flexibilní pumpa, odpovídající moduly multisampleru a detekce (DAD).
• Kolony: ZORBAX Eclipse Plus C18 4,6×150 mm, 5 µm; InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 2,1×50 mm, 2,7 µm; Poroshell 120 SB-C18 2,1×150 mm, 2,7 µm.
• Rozpouštědla: LC-grade voda, acetonitril, methanol, kyselina fosforečná.
• Vzorky: isokratický standard, RRLC mix, suchý extrakt Ganoderma lucidum (USP standard).

Hlavní výsledky a diskuse

Isokratická metoda prokázala vysokou přesnost složení mobilní fáze (RSD <0,15 %) a malé rozdíly retencí (<±1 %) mezi systémy. Rychlý gradient ukázal opakovatelnost retencí (RSD <0,2 %) s relativními odchylkami pod 2 %. Mělký gradient vykázal odchylky retencí až kolem 5 % kvůli citlivosti na drobné změny složení mobilní fáze. Simulace ±0,2 % odchylky objemu organické fáze potvrdila význam metody optimalizované pro tento režim.

Přínosy a praktické využití metody

Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC System poskytuje srovnatelnou výkonnost s běžným systémem při isokratických a rychlých gradientních analýzách a zároveň odolává biochemickým podmínkám. Metody lze snadno přenášet mezi systémy, což usnadňuje validaci nových postupů či modernizaci laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj železo-volných LC systémů umožní širší nasazení v oblasti proteomiky, analýzy nukleových kyselin a dalších bioaplikacích s agresivními pufry. Další vylepšení pumpního míchání a senzoru složení mobilní fáze pomůže zvládnout citlivé gradientní metody. Výhledově se uplatní automatizace přípravy vzorků a online čištění kolony v dynamických pracovních postupech.

Závěr

Oba systémy dosahují vysoké opakovatelnosti a kompatibility u isokratických a rychlých gradientních metod. U mělkého gradientu je nutné upravit metodu tak, aby se minimalizovala citlivost na drobné odchylky složení mobilní fáze. Biokompatibilní systém nabízí přidanou hodnotu pro bioanalytiku bez kompromisů v analytické kvalitě.

Reference

1. Ganoderma lucidum Fruiting Body Monograph, United States Pharmacopeial Convention, 2015.
2. Ganoderma lucidum Fruiting Body Dry Extract Lot Certificate F012B0, USP Catalog No. 1288372, United States Pharmacopeial Convention, 2014.