Mass Spectrometric Characterization of Antibody-RNA Conjugates using the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

Význam tématu

Antibody-RNA konjugáty kombinují selektivitu protilátek s farmakologickými vlastnostmi oligonukleotidů, což otevírá nové možnosti cílené léčby dosud nedostupných biomarkerů. Detailní charakterizace takových konjugátů je klíčová pro optimalizaci stability, dávkování i bezpečnosti terapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a validovat LC/MS metodiku pro analýzu intactních protilátka-RNA (mAb-RNA) konjugátů pod denaturačními i nativními podmínkami, s důrazem na přesné určení poměru šarží s různým počtem připojených nukleotidů (DAR – drug-antibody ratio).

Použitá metodika a instrumentace

Experimentální workflow zahrnovalo:

• Redukční modifikaci protilátky, reakci s aktivovaným RNA linkerem a blokaci reziduálních thiolů.
• Čištění a separaci látek iontově výměnnou chromatografií za účelem izolace frakce DAR=1.
• Denaturační LC/MS analýzu na PLRP-S column za použití Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s rozšířeným mass range do 30 000 m/z.
• Nativní LC/MS analýzu s SEC column a Bio-Rad Bio-Spin P-30 cartridge pro výměnu pufru na 100 mM amoniakální acetát (pH 7).

Hlavní výsledky a diskuse

Denaturační podmínky umožnily detekci disociovaných fragmentů (lehké a těžké řetězce s nebo bez RNA), nicméně přinesly nestabilitu nekovalentních komplexů. Nativní analýza naopak odhalila dvě hlavní formy DAR1 konjugátů s vysokou mírou integrity komplexu. Chromatografická separace pomocí SEC umožnila kvantitativní rozlišení volné protilátky, konjugátů DAR1 a dalších variant.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaná nativní LC/MS metoda přináší:

• Přesné stanovení hmotnosti intactních konjugátů.
• Rychlou separaci různých druhů konjugátů a kvantitativní analýzu jejich zastoupení.
• Možnost sledovat stabilitu a homogenitu přípravy léčiv pro QA/QC procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření nativních MS technik pro vysokokapacitní screening protilátka-oligonukleotidových konjugátů. Integrace automatizovaných separačních systémů a pokročilých softwarových nástrojů pro dekonvoluci spekter umožní ještě rychlejší a přesnější charakterizaci komplexních biokonjugátů.

Závěr

Popsaná metodika kombinující Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF a optimalizované chromatografické kolony poskytuje spolehlivý analytický přístup pro detailní studium intactních mAb-RNA konjugátů pod nativními podmínkami, čímž podporuje vývoj nových terapeutik.

Reference

1. Crooke ST et al. RNA-targeted therapeutics. Cell Metab. 2018;27(4):714-739.
2. Cuellar TL, Siebel CW et al. Systematic evaluation of antibody-mediated siRNA delivery using an industrial platform of THIOMAB-siRNA conjugates. Nucleic Acids Res. 2015;43(2):1189-1203.
3. Sugo T, Terada M, Oikawa T, Matsumoto H et al. Development of antibody-siRNA conjugate targeted to cardiac and skeletal muscles. J Control Release. 2016;237:1-13.