Online 2D-LC Analysis of Complex N-Glycans in Biopharmaceuticals Using the Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution

Význam tématu

Komplexní charakterizace N-vázaných glykosidů u bioterapeutik je klíčová protoze glykosylace ovlivnuje léčivé vlastnosti, stabilitu i imunogenitu. Metoda 2D-LC spojení HILIC a iontově výměnné chromatografie poskytuje vysokou vrstvu separace pro analýzu složitých heterogenních glykánů u erytropoetinu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce je předvést online 2D-LC koncepty pomocí řešení Agilent 1290 Infinity 2D-LC pro vysokorozlišnou analýzu N-glykánů v erytropoetinu. Studie porovnává komplexní dvourozměrné chromatografické režimy (HILIC v první dimenzi, WAX ve druhé) s vícečástečným přístupem heart-cutting pro flexibilní analýzu vybraných vrcholů.

Použitá metodika

Vzorky erytropoetinu a kontrolního proteinu fetuin byly enzymaticky ošetřeny PNGase F a označeny 2-aminobenzamidem pro fluorescenční detekci. Pro separaci se kombinovaly ortogonální techniky HILIC a slabě aniontová výměnná chromatografie (WAX). Při komplexní analýze byla první dimenze HILIC s dlouhým gradientem a druhá WAX s rychlým cyklem. Vícečástečné heart-cutting využívá první dimenzi WAX a druhou HILIC se segmentovanými smyčkami pro klíčové frakce.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary Pump
• Agilent 1290 Infinity Binary Pump
• Agilent 1290 Infinity Autosampler s termostatem
• Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment
• Agilent 1290 Infinity Valve Drive s ventily 2P4P a 6P14P s dvanácti 40 µL smyčkami
• Agilent AdvanceBio Glycan Mapping kolony
• Agilent Bio WAX kolony
• Agilent 1260 Infinity Fluorescence Detector
• Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS
• Software Agilent OpenLAB CDS a MassHunter Workstation

Hlavní výsledky a diskuse

Komplexní 2D-LC kombinace HILIC/WAX prokázala výrazné zvýšení kapacity a selektivity oddělení glykosidických izofor podle jejich náboje. Druhá dimenze WAX zvětšuje rozlišení a usnadňuje přiřazení počtu sialů. Vícečástečný heart-cutting režim umožnil delší gradienty ve druhé dimenzi a odhalil skryté vrcholy, které se v jednom rozměru jevily pouze jako plechy.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizovaná online analýza bez offline sběrů frakcí s výrazným zkrácením celkového času
• Současná informace o strukturální rozmanitosti a nábojovém profilu glykánů
• Zjednodušení přiřazení glykoizofor v souladu s regulatorními požadavky
• Rozšíření QC procesu a urychlení vývoje biotechnologických léčiv

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další integrace s vysokorozlišnou hmotnostní spektrometrií, pokročilá datová analýza glyko-dat pomocí strojového učení a vývoj nových stacionárních fází pro ještě vyšší ortogonalitu. Metoda lze aplikovat i na rozsáhlé glykomické studie dalších bioterapeutik.

Závěr

Navržené řešení Agilent 1290 Infinity 2D-LC spojující HILIC a WAX umožňuje online oba režimy – komplexní i heart-cutting – s vysokým rozlišením, kratší dobou analýzy a plnou automatizací, což je klíčové pro detailní charakterizaci glykoprofilu u biopharmaceutical produktů.

Reference

1. Egrie JC a kol. Characterization and biological effects of recombinant human erythropoietin. Immunobiology 1986;172:213-224.
2. Egrie JC, Browne JK. Development and characterization of novel erythropoiesis stimulating protein NESP. British Journal of Cancer 2001;84(Suppl 1):3-10.
3. Bones J a kol. 2D-LC Analysis of BRP 3 Erythropoietin N-Glycosylation using Anion Exchange Fractionation and Hydrophilic Interaction UPLC Reveals Long Poly-N-Acetyl Lactosamine Extensions. Anal Chem 2011;83(11):4154-4162.
4. Schneider S, Potter O. N-Glycan Analysis of mAbs and Other Glycoproteins with UHPLC and Fluorescence Detection. Agilent Technologies Application Note 5991-5253EN, 2014.