Qualitative Analysis of Fish Oil Triglycerides with Supercritical Fluid Chromatography and Q-TOF MS

Význam tématu

Analýza triglyceridů v rybím oleji je klíčová pro charakterizaci nutričních a bioaktivních složek, kontrolu kvality potravin a doplňků stravy. Komplexní složení rybího tuku, zahrnující stovky různých molekul rostoucí odlišnostmi počtu uhlíků a stupněm nenasycenosti, klade vysoké nároroky na separační a detekční techniky. Kombinace superkritické fluidní chromatografie (SFC) s vysokoremolucní hmotnostní spektrometrií Q-TOF přináší značné zrychlení analýzy, vyšší rozlišení a citlivost, které jsou dnes ve výzkumu i průmyslové praxi nezbytné.

Cíle a přehled studie

Tato aplikace představuje qualitativní profilaci složek rybího oleje pomocí SFC/Q-TOF MS. Hlavním cílem bylo:

• Vyvinout robustní rozhraní mezi SFC a Q-TOF MS s elektrosprayovou (ESI) ionizací v pozitivním modu
• Zkrátit dobu analýzy na několik minut při zachování vynikající separace až stovek komponent
• Dosáhnout výrazně vyšší citlivosti než při detekci UV a umožnit identifikaci pomocí přesné hmotnosti a lipidových databází

Použitá metodika a instrumentace

Většina měření proběhla na přístrojové sestavě SFC Agilent 1260 Infinity coupled to Agilent 6540 UHD Accurate Mass Q-TOF MS s Dual Agilent Jet Stream ESI v pozitivním modu. Klíčové parametry:

• Mobilní fáze: čisté CO2 s metanolem obsahujícím 5 mM acetátu amonného jako modifikátoru
• Kolonové sety: Agilent ZORBAX 300SB-C18 (4,6×150 mm, 3,5 µm) a ZORBAX SB-C18 (3×100 mm, 1,8 µm)
• Teplota kolony 40–60 °C, průtok 0,5–3 mL/min, tlak 140 bar za kolonou
• Post-kolonový split 10:1 pomocí 1 m kapiláry 50 µm s make-up tokem čistého metanolu
• MS parametry: teplota zdroje 325 °C, průtok sušícího plynu 10 L/min, nebulizér 25 psi, kapilární napětí 3500 V, skimmer 45 V, fragmentor 165 V
• Software: Agilent MassHunter a in-house lipidové databáze

Hlavní výsledky a diskuse

Analýzou vzorku rybího oleje bylo v čase kratším než 15 minut detekováno až 400 unikátních hmotností bez významných překryvů. Ve srovnání s UV detekcí při 230 nm došlo k více než tisícnásobnému zlepšení citlivosti. Mass versus retention time plota prokázala prakticky lineární rozlišení molekul podle stupně nenasycenosti (#DB) s menším vlivem celkového počtu uhlíků (CN). Partition number (PN) vypočtený buď jako CN – 2×#DB, nebo CN – #DB nepředpovídal eluci dostatečně spolehlivě. Data ukázala:

• Rozlišení až 9 strukturálních izomerů triglyceridů se stejným CN a různým uspořádáním dvojitých vazeb
• Identifikace desítek diglyceridů, fosfolipidů, volných mastných kyselin, flavonoidů, terpenoidů a prekurzorů vitaminu D3
• Objev triglyceridů s lichým počtem uhlíků (C17) ve vedlejších pozicích
• Gaussovo rozdělení relativní abundance podle CN s maximem u C63

Přínosy a praktické využití metody

Metoda SFC/Q-TOF MS poskytuje:

• Rychlou a komplexní charakterizaci lipidového profilu
• Vysokou citlivost pro stopové složky
• Možnost spolehlivé identifikace dle přesné hmotnosti a databází
• Environmentálně šetrné chromatografické podmínky díky využití CO2
• Vysokou propustnost pro rutinní kontroly kvality v potravinářství a farmaceutickém průmyslu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• Rozšíření databází pro automatickou identifikaci komplexních lipidů
• Integraci s více dimenzionálními chromatografickými systémy (SFC×LC)
• Implementaci kvantitativních protokolů a izotopově značených standardů
• Využití AI a strojového učení pro pokročilou analýzu dat a vzorování
• Zlepšení udržitelnosti mobilních fází a snížení spotřeby organických rozpouštědel

Závěr

Propojení superkritické fluidní chromatografie s Q-TOF hmotnostní spektrometrií umožňuje rychlou, vysoce citlivou a selektivní kvalitativní analýzu triglyceridů v rybím oleji. Metoda odhaluje široké spektrum lipidů, včetně izomerů a stopových složek, a je vhodná pro výzkum, QA/QC i průmyslovou analytiku.

Reference

1. A. H. El-Handy, E. G. Perkins, J. Am. Oil Chem. Soc. 58, 868 (1981)
2. G. Dobson, W. W. Christie, B. Nikolova-Damyanova, J. Chromatogr. B. 671, 197 (1995)
3. E. Lesellier, A. Tchapla, Supercritical Fluid Chromatography with Packed Columns, Marcel Dekker (1990)
4. E. Lesellier, A. Tchapla, Chromatographia 51, 688 (2000)
5. L. G. Blomberg, M. Demirbuker, P. E. Andersson, J. Am. Oil Chem. Soc. 70, 939 (1993)
6. P. Sandra, A. Medvedovici, Y. Zhao, F. David, J. Chromatogr. A. 974, 231 (2002)
7. L. Mondello, et al., J. Chromatogr. A. 1086, 91 (2005)
8. I. Francois, P. Sandra, J. Chromatogr. A. 1216, 4005 (2009)
9. P. Dugoa, et al., J. Chromatogr. A. 1259, 227 (2012)
10. E. Lesellier, A. Latosa, A. Lopes de Oliveira, J. Chromatogr. A. 1327, 141 (2014)
11. J. W. Lee, et al., J. Biosci. Bioeng. 113, 262 (2012)
12. K. Horia, et al., J. Chromatogr. A. 1250, 99 (2012)
13. T. Uchikata, et al., J. Chromatogr. A. 1250, 205 (2012)
14. T. Yamada, et al., J. Chromatogr. A. 1301, 237 (2013)
15. M. Garzotti, L. Rovatti, M. Hamdan, Rapid Commun. Mass Spectrom. 15, 1187 (2001)
16. M. Méjean, A. Brunelle, D. Touboul, Poster, 2012 International Symposium of SFC, Basel
17. Q. Zhou, B. Gao, X. Zhang, Y. Xu, H. Shi, L. Yu, Food Chemistry 143, 199 (2014)
18. C. Baiocchi, et al., Chromatographia 37, 525 (1993)
19. A. Stabey, et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 71, 355 (1994)
20. C. Borch-Jensen, J. Mollerup, Chromatographia 42, 252 (1996)
21. M. N. Dunkle, F. David, P. Sandra, M. Volmer, Agilent Application Note 5991-0987EN (2012)