A Novel HILIC Column for High Speed N-linked Glycan Analysis

Význam tématu

Vývoj HPLC metod pro chemickou a farmaceutickou analýzu vyžaduje optimalizaci selektivity, účinnosti a retence s cílem zajistit vysoké rozlišení a robustnost separací. Využití mobilní fáze s pH nad 7 poskytuje silný nástroj pro řízení retence ionizovatelných sloučenin, což rozšiřuje možnosti metodického vývoje v RPLC a LC–MS.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat, jak lze za pomoci Agilent Poroshell HPH-C18 kolony při zvýšeném pH:

• řídit selektivitu separace kyselých, bazických a neutrálních analyz,
• zlepšit tvar a intenzitu píků při LC–MS v režimu pozitivního ESI,
• ověřit dlouhodobou stabilitu kolony při pH 10 během více než 2000 injekcí.

Použitá metodika a instrumentace

Pro experimenty byl použit Agilent 1260 Infinity LC systém s následujícími přístroji:

• Binary Pump G1312B
• Automatic Liquid Sampler G1367C
• Thermostatted Column Compartment G1316C
• Diode Array Detector G4220A
• Poroshell HPH-C18 kolony 2.1×50 mm a 4.6×50 mm (2.7 µm)
• Volitelné LC/MS rozhraní Agilent 6140D Single Quadrupole

Mobilní fáze obsahovala volitelné pufry (10 mM amonný formiát, acetát nebo hydrogenuhličitan) s úpravou na pH 3–10 a organický modifikátor acetonitril nebo methanol.

Hlavní výsledky a diskuse

• Změna pH mobilní fáze dramaticky ovlivnila pořadí eluce kyselých (retence se zkracuje při vysokém pH) a bazických sloučenin (retence se prodlužuje při pH vyšším než jejich pKa).
• Korelační analýza retencí (pH 3 vs. pH 10) ukázala nižší koeficient R2 přibližně 0,5–0,6, což svědčí o ortogonální selektivitě.
• V režimu ESI+ byly při pH 10 detekovány zásadité látky (lidokain, procainamid, diltiazem) s lepšími tvary piků a vyššími intenzitami signálu díky vyšší parciální volatilnosti organické fáze.
• Stabilita Poroshell HPH-C18 kolony při pH 10 a teplotě 25 °C byla prokázána více než 2000 injekcemi bez výrazné ztráty retence či degradace, zatímco konkurenční kolona vykazovala změny retence již po cca 500 injekcích.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a flexibilní ladění selektivity separace ionizovatelných analytů bez nutnosti výměny kolony či složitých gradientů.
• Zlepšená citlivost a tvar piků v LC–MS pro zásadité sloučeniny.
• Vysoká odolnost kolony přispívá k dlouhodobé reproducibilitě a nákladové efektivitě v rutinní praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj kolonních materiálů s rozšířenou stabilitou i v extrémních pH a teplotách.
• Integrace vysokopH RPLC v komplexních workflows QC, metabolomiky a protéomiky.
• Automatizace metodického vývoje pomocí algoritmů QbD zahrnujících pH jako hlavní proměnnou.

Závěr

Zvýšení pH mobilní fáze na hodnoty až kolem 10 představuje efektivní způsob optimalizace selektivity a citlivosti v RPLC a LC–MS analýzách ionizovatelných sloučenin. Agilent Poroshell HPH-C18 kolony kombinují vysokou účinnost separace, odolnost vůči vysokému pH a dlouhodobou stabilitu potřebnou pro rutinní farmaceutickou a průmyslovou analytiku.

Reference

1. L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.W. Dolan. Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd Edition, John Wiley & Sons, 2010.
2. Agilent Technologies. Transfer of Methods Between Poroshell 120 EC-C18 and ZORBAX Eclipse Plus C18 Columns, 2011.
3. K. Croes et al., J. Chromatogr. A 1098, 123 (2005).
4. W. Long, A. Mack. Agilent Technologies Application Note, 2009.
5. Raluca-Iona Chirita-Tampu et al., LC.GC Europe, 26, 128 (2013).