Separation of Polyphenols by Comprehensive 2D-LC and Molecular Formula Determination by Coupling to Accurate Mass Measurement

Význam tématu

Polyfenoly jsou důležité bioaktivní látky s antioxidačními vlastnostmi, běžně přítomné v ovoci, zelenině, nápojích a potravinových doplňcích. Jejich analýza v komplexních matricích vyžaduje kombinaci vysoce selektivní chromatografie a hmotnostní spektrometrie s přesným měřením hmotnosti.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat snadné propojení Agilent 1290 Infinity 2D-LC se systémem Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS za účelem komplexní separace a identifikace 22 polyfenolických standardů. Autoři využili software LC×LC Imaging k extrakci profilů m/z přímo z 2D chromatogramu a určení molekulárních vzorců s vysokou přesností.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution s dvěma binárními pumpami, autosamplerem, termostatovanou kolonkou a DAD detektorem.
• MS detekce: Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF nebo Agilent 6238 Accurate-Mass TOF LC/MS s elektrospray ionizací a t-spojkou pro přepojení druhé dimenze.
• Kolony: 1. dimenze C18 2.1×150 mm 1.8 µm; 2. dimenze Phenyl-Hexyl 3.0×50 mm 1.8 µm.
• Gradientní eluce s vodou a organickým rozpouštědlem s 0,1 % formiové kyseliny, modulace každých 30 sekund.
• Software: Agilent OpenLab CDS s 2D-LC modulem, MassHunter pro TOF/Q-TOF a LC×LC Imaging pro HiRes MS 2D-LC.

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozdělení 22 polyfenolů s retenčními časy v první dimenzi 3,5–23,5 min a v druhé dimenzi 2,5–22,4 s.
• Massová přesnost většiny sloučenin pod 2 ppm; galová kyselina 0,28 ppm, hesperidin 0,48 ppm, resveratrol 1,18 ppm a pinosylvin 1,64 ppm.
• Úspěšná separace strukturálně podobných sloučenin (luteolin/quercetin, apigenin/naringenin) díky odlišné selektivitě druhé dimenze.
• Extrahované profilové spektra z 2D-LC TOF dat umožnila spolehlivé určení molekulárních vzorců v rozsahu C3-35H7-72O1-20.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a účinná analýza komplexních polyfenolických vzorků v potravinářském a agronomickém průmyslu.
• Vysoká selektivita a přesnost podporují jednoznačnou identifikaci a kvantifikaci isomerů.
• Metoda je vhodná pro QA/QC laboratoře, vývoj funkčních potravin a sledování bioaktivních látek ve výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace spojení 2D-LC a HRMS pro komplexní metabolomické studie.
• Integrace iontové mobility a tandemové MS pro zlepšení selektivity a strukturní elucidace.
• Personalizovaná nutrigenomika se sledováním metabolitů polyfenolů v klinických vzorcích.

Závěr

Kombinace Agilent 1290 Infinity 2D-LC a Accurate-Mass TOF/Q-TOF MS nabízí vysokou selektivitu separace a přesnost měření hmotnosti polyfenolů, což usnadňuje kvalitativní i kvantitativní analýzu v náročných potravinářských a biologických vzorcích.

Reference

• Naegele E Qualitative and quantitative determination of phenolic antioxidant compounds in red wine and fruit juice with the Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution Agilent Technologies Application Note publication number 5991-0426EN 2012