Sensitive Detection of Three Forms of Thyroid Hormone in Human Serum Using the Agilent 6490 Triple Quadrupole LC/MS System

Význam tématu

Měření volných a celkových forem tyreoidálních hormonů (T4, T3, rT3) v lidském séru poskytuje zásadní informace o funkci štítné žlázy a metabolem endokrinního systému. Koncentrace volných hormonů v řádu pg/mL je klíčová pro diagnostiku onemocnění, sledování terapií i výzkum regulačních mechanismů.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout rychlou, citlivou a validovanou LC/MS/MS metodu umožňující simultánní stanovení volné i vázané formy T4, T3 a rT3 v lidském séru s výrazně zkrácenou dobou analýzy (6,5 minuty) a vynikající lineární oblastí (0,5–1000 pg/mL).

Použitá metodika

Pro volné hormony byla použita ultrafiltrace (Amicon YM-30), následuje precipitace acetonitrilem. Pro celkové formy metodika zahrnovala kapalně-kapalnou extrakci (ethyl acetát) po proteinové denaturaci. Rekonstituce po odpaření extraktu proběhla ve směsi vody a acetonitrilu (75:25). Kvantifikace se provádí pomocí MRM v pozitivním ionizačním režimu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity LC System
• Agilent 6490 Triple Quadrupole LC/MS System s Agilent JetStream
• Kolonka Poroshell 120 EC-C18 (3,0×100 mm, 2,7 μm)
• Gradientní eluce: 0–5 min 30→50 % acetonitrilu, 5,1–5,4 min 98 % acetonitrilu
• MRM přechody pro T4, T3, rT3 včetně 13C-značených interních standardů

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala excelentní linearitu (R² ≥0,990) v celém rozsahu. Dolní mez kvantifikace (LLOQ) se pohybuje 1–5 pg/mL pro volné a 0,5–2,5 pg/mL pro celkové koncentrace. Chromatografická separace T3 a rT3 byla ostrá, což minimalizuje interferenci izobarických látek. Analytické opakovatelnosti a přesnost splňují požadavky klinické praxe.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza: pouze 6,5 minuty na vzorek
• Vysoká citlivost pro nízké pg/mL koncentrace
• Možnost simultánního stanovení volných a vázaných forem
• Vhodné pro rutinní klinické laboratoře i výzkumné projekty

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze dále rozšířit o multiplexní stanovení dalších endokrinních markérů. Miniaturizace a automatizace přípravy vzorků zvýší propustnost. Kombinace s vysoce rozlišenou hmotnostní spektrometrií (HRMS) může zlepšit selektivitu a detekci neočekávaných metabolitů.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda umožňuje citlivé a specifické stanovení tří forem tyreoidálních hormonů v séru s krátkou dobou analýzy a širokým dynamickým rozsahem. Je ideální pro klinický výzkum a diagnostiku poruch štítné žlázy.

Reference

• Rory Doyle, Kevin McCann: Sensitive Detection of Three Forms of Thyroid Hormone in Human Serum Using the Agilent 6490 Triple Quadrupole LC/MS System, Application Note, Agilent Technologies, 2014
• NIST SRM 971: Standard Reference Material for thyroid hormones