ROUTINE MONITORING OF N-GLYCANS USING A NOVEL LABELING REAGENT WITH FLUORESCENCEAND MASS DETECTION

Význam tématu

V oblasti biotechnologické výroby léčiv představuje detailní kontrola glykosylace proteinu klíčový faktor kvality a bezpečnosti finálního produktu. Profil N-glykanů ovlivňuje farmakokinetiku, imunogenicitu i stabilitu bioterapeutik. Tradiční metody analýzy glykosidů jsou časově náročné a vyžadují komplexní přípravu vzorků či specializované MS pracovníky. Zavedení rychlého a citlivého postupu umožňuje efektivní monitorování během vývoje a výroby, což vede ke zkrácení doby analýz a zajištění konzistentní kvality bioproduktů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit novou znažovací látku RapiFluor-MS pro fluorescence a hmotnostní detekci N-glykanů u bioterapeutik. Autoři demonstrovali:

• zkrácení přípravy vzorku na 30 minut
• 14násobný nárůst fluorescence a 160násobný nárůst MS signálu oproti běžné značce 2-AB
• zavedení workflow UPLC-FLR-QDa pro rutinní a vysoce propustné sledování glykosylace

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky glykoproteinů (humánní IgG, RNase B, bílkovina fetuin) byly ošetřeny PNGasa F, označeny RapiFluor-MS a analyzovány pomocí UPLC-HILIC s fluorescence a QDa hmotnostním detektorem. Klíčová instrumentace:

• Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio s FLR detektorem (lex=265 nm, lem=425 nm) a QDa (m/z 500–1250, Cone 15 V, Capillary 1,5 kV)
• Kolona ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide 130 Å, 1,7 µm, 60 °C
• Mobilní fáze A: acetonitril LC-MS; B: 50 mM ammonium formiát, pH 4,4

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky ukázaly, že všechny testované glykany (od malých bi-antennárních až po tetra-sialylované) byly plně rozlišené v HILIC srovnání fluorescence a QDa. Nové značení zvýšilo citlivost tak, že i glykan s relativní zastoupením pod 0,5 % byl detekovatelný hmotnostním detektorem. Geometrické zmenšení kolony a zvýšení průtoku zkrátilo dobu analýzy šestinásobně, přičemž některé špičky částečně ko-elovaly, řešitelné pomocí SIR (selected ion recording). Aplikace SIR umožnila odlišit ko-elující struktury (např. M5 vs. A2G1) a kvantifikovat změny hladin glykanů přidaných do modelové matrice trastuzumabu.

Přínosy a praktické využití metody

Implementované řešení přináší:

• rychlou a jednoduchou přípravu vzorku bez nutnosti derivatizace přes noc
• komplexní detekci fluorescence i hmotnostním detektorem na jednom přístroji
• zvýšenou propustnost laboratoře s možností neustálého sledování kritických glykanových atributů
• snazší identifikaci ko-elujících glykanů díky SIR

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj:

• integrace s online bioprocesními platformami pro nepřetržitý monitoring
• automatizace přípravy vzorků ve vysokopropustných laboratořích
• rozšíření znažicích reagentů pro O-glykanové a jiné cukerné struktury
• využití pokročilých algoritmů AI pro interpretaci MS dat

Závěr

Znaživo RapiFluor-MS v kombinaci s UPLC-FLR-QDa nabízí rychlý, citlivý a rutinně použitelný postup pro sledování N-glykanů u bioterapeutik. Výrazné zvýšení fluorescence i MS signálu umožňuje detailní charakterizaci i stopových glykanů a SIR přináší řešení ko-elucí. Tato metodika významně zkracuje dobu analýz a usnadňuje rozhodovací proces v rámci vývoje a výroby bioléčiv.

Reference

Cosgrave EFJ, Lauber MA, Koza SM, McCarthy SM, Chakraborty A. Routine monitoring of N-glycans using a novel labeling reagent with fluorescence and mass detection. Waters Corporation, 2015.