ROUTINE MONITORING OF N-GLYCANSUSING A NOVEL LABELING REAGENT WITH FLUORESCENCE AND MASS DETECTION

Význam tématu

Profilace N-glykanů je základním krokem při vývoji a výrobě bioterapeutik, kde glykosylace ovlivňuje stabilitu, účinnost i imunogenicitu léčiv. Kvalitní a rychlá analýza glykánových profilů je proto klíčová pro udržení konzistence výroby a splnění regulatorních požadavků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo zavést novou značení reakčním činidlem RapiFluor-MS, které současně poskytuje silnou fluorescenční odezvu i citlivé hmotnostní detekční signály. Autoři představili workflow kombinující UPLC-FLR a QDa detekci pro rutinní sledování uvolněných N-glykanů za výrazně zkráceného času přípravy vzorku.

Použitá instrumentace

• Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio s fluorescenčním detektorem (FLR)
• Waters ACQUITY QDa hmotnostní detektor
• UPLC Glycan BEH Amide column, 130 Å, 1.7 µm

Použitá metodika

Glykany byly uvolněny PNGasou F, označeny RapiFluor-MS činidlem a odděleny HILIC UPLC metodou. Byly srovnány konvenční a vysoce průtokové gradienty, což umožnilo až šestinásobné zkrácení doby analýzy. QDa pracoval v režimu TIC a vybraných ionty (SIR) v rozsahu 300–1250 m/z.

Hlavní výsledky a diskuse

Označení RapiFluor-MS přineslo až 14× vyšší fluorescenční signál a 160× vyšší hmotnostní citlivost oproti tradičnímu 2-AB značení. FLR i QDa detekce prokázaly schopnost zachytit široké spektrum glykánových struktur od malých neutrálních až po komplexně sialylované. Kvalita QDa spekter umožnila jednoznačnou identifikaci izomerů. Pomocí SIR byly úspěšně rozlišeny a kvantifikovány koelutující struktury, např. M5 a A2G1.

Přínosy a praktické využití metody

Nové značení spolu s kombinovanou UPLC-FLR/QDa detekcí výrazně zrychluje workflow, zvyšuje spoolehlivost identifikace glykánů a umožňuje rychlé rozhodování v rámci QA/QC laboratoří. Vyšší citlivost přináší možnost monitorovat i nízkoabundantní struktury (<0,5 % RPA).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj multiplexních a automatizovaných přístupů, integrace s vysokorozlišovacími hmotnostními spektrometry pro detailní strukturní analýzu a nasazení inline monitoringu glykosylace v bioprocesních výrobních linkách.

Závěr

Studie dokládá, že RapiFluor-MS značení ve spojení s UPLC-FLR a QDa detekcí představuje efektivní a robustní nástroj pro rutinní sledování N-glykanů v bioterapeutikách. Metoda nabízí vysoký výkon, široké spektrum detekce a významné zkrácení času přípravy a analýzy.

Reference

• Cosgrave EFJ, Lauber MA, Koza SM, McCarthy SM. Routine monitoring of N-glycans using a novel labeling reagent with fluorescence and mass detection. Waters Corporation, 2015.