Increasing Specificity and Sensitivity in Routine Peptide Analyses Using Mass Detection with the ACQUITY QDa Detector

Význam tématu

Precizní analýza peptidových fragment v procesu vývoje a kontroly bioterapeutik je klíčová pro zajištění identity, čistoty a stability terapeutických protilátek. Konvenční optická detekce v HPLC/UPLC poskytuje rychlou odezvu, avšak může selhávat při rozlišení souběžně eluujících peptidů a modifikovaných forem, jako je deamidace. Zařazení hmotnostní detekce jako ortogonální techniky umožňuje vyšší specifičnost, citlivost a důvěru při kvantifikaci kritických kvalitativních atributů (CQA) bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Tato studie demonstruje integraci detektoru ACQUITY QDa do stávajících UPLC metod pro rutinní analýzu peptidů z monoklonálních protilátek. Hlavním cílem bylo ověřit, že přídavná hmotnostní detekce zvyšuje specifičnost a citlivost bez významné změny chromatografického protokolu a současně zjednodušuje posouzení homogenity píků obsahujících klíčové CDR sekvence.

Použitá metodika

Pro přípravu vzorku byl redukovaný a alkylovaný trastuzumab tráven trypsinem při koncentraci 0,5 mg/ml podle protokolu výrobce. Chromatografické separace probíhaly na ACQUITY UPLC H-Class systému s kolonkou Peptide CSH C18 (130 Å, 1,7 µm, 2,1×100 mm). Teplota kolony 65 °C, vzorku 10 °C, objem injekce 8 µl. Mobilní fáze A voda/0,1 % kyseliny mravenčí, B acetonitril/0,1 % kyseliny mravenčí, gradient od 1 do 80 % fáze B během 130 minut při průtoku 0,2 ml/min. Optická detekce pomocí TUV detektoru na vlnové délce 215 nm, hmotnostní detekce v pozitivním režimu na QDa při rozsahu 350–1250 Da, koncovém napětí 1,5 kV a teplotě sondy 500 °C. Data zpracována v Empower 3 CDS.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class systém
• Peptide CSH C18 kolona (130 Å, 1,7 µm, 2,1×100 mm)
• ACQUITY UPLC Tunable UV detektor (215 nm)
• ACQUITY QDa detektor (hmotnostní rozsah 350–1250 Da, SIR režim)
• Empower 3 Chromatography Data Software

Hlavní výsledky a diskuse

Optická chromatografie odhalila souběžné eluování kritického CDR peptidu L3 a jeho deamidované formy L3D společně s dalšími peptidy na pozadí šumu. Využitím QDa detektoru bylo možné vygenerovat extrahovaný iontový chromatogram (XIC), který potvrdil přítomnost více koeluujících druhů. Programované Single-Ion-Recording (SIR) události na +2 a +3 nabití umožnily selektivní snímání iontů L3 a L3D během definovaných intervalů. Výsledné chromatogramy vykázaly vysoký poměr signál/šum a odstranily rušivé souběžné signály. Pomocí inter-channel výpočtů v Empower CDS byla stanovena relativní míra deamidace CDR peptidu na 8,28 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduché doplnění stávajících UPLC metod bez nutnosti zásadní úpravy chromatografie
• Zvýšená specifičnost a citlivost díky ortogonální detekci hmotností
• Rychlejší a spolehlivější potvrzení homogenity píků při sledování CQA
• GMP kompatibilita a centralizované řízení dat v Empower 3 CDS
• Úspora času a nákladů oproti rozsáhlé optimalizaci chromatografických podmínek

Budoucí trendy a možnosti využití

Se zmenšujícími se rozměry hmotnostních detektorů a zvyšující se výpočetní kapacitou lze očekávat širší nasazení pevnokrokových MS-detekčních systémů ve vývoji i rutině QC laboratoří. Dalšími směry jsou automatizace výběru SIR metod, integrace s pokročilou analýzou dělených dat a využití strojového učení pro detekci vzorů modifikací. Metoda je přenosná na jiné proteinové modifikace a lze ji rozšířit na multiplexní monitoring více CQA v reálném čase.

Závěr

Integrace hmotnostní detekce pomocí ACQUITY QDa do rutinních peptidových analýz poskytuje významný krok ke zvýšení specifičnosti a citlivosti sledování kritických kvalitativních atributů bioterapeutik. Metoda vyžaduje minimální úpravy existujících protokolů, nabízí rychlé zpracování dat a vyšší jistotu při kvantifikaci modifikovaných forem peptidů.

Reference

1. Rathore A Winkle H Quality by design for biopharmaceuticals Nat Biotechnol 2009 Jan 27(1) 26–34
2. Goetze A Schenauer M Flynn G Assessing monoclonal antibody product quality attribute criticality through clinical studies mAbs 2010 Sep-Oct 2(5) 500–7
3. Birdsall R Cosgrave E McCarthy S Adding Mass Detection to Routine Peptide-Level Biotherapeutic Analyses with the ACQUITY QDa Detector Waters Application Note 2015 p n 720005266EN
4. Vlasak J et al Identification and characterization of asparagine deamidation in the light chain CDR1 of a humanized IgG1 antibody Anal Biochem 2009 Sep 15 392(2) 14–54
5. Harris R Kabakoff B Macchi F Shen F Kwong M Andya J Shire S Bjork N Totpal K Chen A Identification of multiple sources of charge heterogeneity in a recombinant antibody J Chromatogr B Biomed Sci Appl 2001 Mar 10 752(2) 233–45