Ultra Fast Analysis of Amino Acids in Cultured Cell Extracts Using UHPLC/MS/MS

Význam tématu

Analýza aminokyselin je klíčová pro studium metabolického profilu buněk a biochemických drah. Tradiční iontově-výměnné HPLC s postkolonovou derivatizací vyžaduje více než dvě hodiny a postrádá dostatečnou selektivitu pro stopové koncentrace aminokyselin za přítomnosti složitého biologického matrix.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout vysoce selektivní a ultra rychlou metodu pro kvantifikaci 36 proteinogenních i non-proteinogenních aminokyselin a dipeptidů v extraktech z kultivovaných buněk. Metoda kombinuje pre-kolónní derivatizaci a reverzní fázovou UHPLC/MS/MS.

Použitá metodika

Vzorky byly připraveny pomocí soupravy EZ:faast (Phenomenex): přidání interních standardů, SPE a derivatizace alkylchloroformátem, doba přípravy ~7 minut.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Shimadzu Nexera
• Kolona Phenomenex Kinetex C18 (2,1×150 mm, 1,7 µm)
• Triple kvadrupólový hmotnostní spektrometr Shimadzu LCMS-8030
• Režim ESI pozitivní, MRM skenování

Hlavní výsledky a diskuse

• Šlo analyzovat 36 aminokyselin za 7 minut chromatografie (+7 minut příprava).
• Kalibrační křivky vykázaly korelační koeficienty R ≥ 0,98 a LLOQ v rozsahu 2–500 pmol/ml.
• Reprodukovatelnost (CV) všech analyzovaných látek byla pod 12 %.
• Aplikace na extrakty lidských kolorektálních nádorových a fibroblastních buněk prokázala detekci aminokyselin v pmol až nmol rozsahu bez výrazné potlačení signálu matrix.
• Recovery testy osm vybraných aminokyselin vykázaly 80–120 %.

Přínosy a praktické využití metody

Díky vysoké rychlosti a selektivitě lze metodu využít v metabolomických studiích, farmaceutickém vývoji i rutinní QA/QC analýze. Krátký čas analýzy zvyšuje propustnost laboratoře a snižuje spotřebu organických rozpouštědel.

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace vzorkování a integrace s pokročilou datovou analýzou umožní rozšířit spektrum detekovaných metabolitů. Metoda má potenciál pro klinickou diagnostiku, toxikologii a průmyslovou kontrolu kvality.

Závěr

Reverzní fázová UHPLC/MS/MS s pre-kolónní derivatizací poskytuje ultra rychlou a vysoce selektivní analýzu aminokyselin v kultivovaných buněčných extraktech. Celkový čas odběru vzorku, přípravy a analýzy je 14 minut, přičemž se dosahují nízké limity detekce a minimální matrix interference.