Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Novel Fluorescence and MS-Active Labeling Reagent

Význam tématu

Profil N-glykanů patří mezi klíčové kvalifikátory bioterapeutik, ovlivňuje jejich účinnost, bezpečnost a výrobní podmínky.
Rychlé a citlivé metody uvolňování a označení N-glykanů umožňují přesnou charakterizaci a zkracují dobu analýzy, což urychluje vývoj i kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlý a vysoce citlivý postup přípravy uvolněných N-glykanů pro analýzu HILIC-FLR-MS.
Nový několikanásobně citlivější fluorescenční a MS-aktivní označující reagens RapiFluor-MS byl integrován s rychlou deglykozylací a jednoduchou čistící SPE procedurou.

Použitá metodika a instrumentace

• Deglykozylace: Rapid PNGase F ve spojení s surfaktantem RapiGest SF, 2 min při ≥80 °C + 5 min při 50 °C.
• Označení: RapiFluor-MS (NHS-karbamat rapid tagging + fluorescenční kvorolinový fluorofor + terciární aminoskupina) za 5 min.
• Čištění: HILIC µElution SPE (silika aminopropyl), eluční pufr 200 mM acetát, pH 7.
• Chromatografie: ACQUITY UPLC H-Class Bio System, kolumna Glycan BEH Amide 130 Å (2.1 × 50 mm/150 mm, 1.7 µm).
• Detekce: FLR (Ex 265/Em 425 nm) a MS (ACQUITY QDa, SYNAPT G2-S HDMS, Xevo G2-XS QTof, ESI+).
• Software: MassLynx, instrukce GlycoWorks.

Hlavní výsledky a diskuse

• Reagens RapiFluor-MS umožňuje označení glykozylaminů v akválním prostředí bez reduktivní aminačního kroku.
• Označení RapiFluor-MS vedlo k 2× vyššímu fluorescenčnímu signálu a 780× vyššímu MS signálu než Instant AB.
• Ve srovnání s 2-AB bylo dosaženo 14× nárůstu FLR a 160× nárůstu MS signálu.
• Rychlá deglykozylace (~10 min) poskytuje účinnost srovnatelnou s konvenčními postupy (≥1 h), potvrzeno SDS-PAGE.
• HILIC SPE zajišťuje >70 % absolutní obnovu a přesné relativní kvantifikace i u tetrasialylovaných forem.

Přínosy a praktické využití metody

Díky celkové 30minutové přípravě (deglykozylace + značení + SPE) je metoda vhodná pro vysokoprůchodové i rutinní QA/QC aplikace.
Vysoká citlivost FLR a ESI-MS usnadňuje detekci i v nízkých koncentracích a detailní charakterizaci glykoform.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Aplikace v komplexních biologických matricích (serum, buněčné lizáty).
• Automatizace a miniaturizace workflow pro vysokou propustnost.
• Rozšíření na analýzu O-glykanů a dalších posttranslačních modifikací.
• Integrace s pokročilými MS metodami (IMS-MS, vysoké rozlišení) pro hloubkovou molekulární charakterizaci.

Závěr

Navržený postup poskytuje unikátní spojení rychlé přípravy, jednoduchosti a extrémně vysoké citlivosti FLR i MS detekce N-glykanů.
RapiFluor-MS reagens v kombinaci s rychlou deglykozylací a HILIC SPE zkracuje čas analýzy na 30 min a zvyšuje výkonnost analytických procesů v biotechnologii.

Reference

• Beck A. a kol. Anal Chem. 2013;85(2):715–736.
• Dalziel M. a kol. Science. 2014;343(6166):1235681.
• Kaneshiro K. a kol. Anal Chem. 2012;84(16):7146–7151.
• Ahn J. a kol. J Chromatogr B. 2010;878(3-4):403–408.
• Yu Y.Q. Waters Appl. Note. 2010;720003576.
• Hilliard M. a kol. Waters Appl. Note. 2012;720004203.
• Hilliard M. a kol. Waters Appl. Note. 2012;720004202.
• Yu Y.Q. Waters Appl. Note. 2011;720004019.
• Marino K. a kol. Nat Chem Biol. 2010;6(10):713–723.
• Gillece-Castro B. a kol. Waters Appl. Note. 2009;720003112.
• Mechref Y. a kol. Mol Cell Proteomics. 2013;12(4):874–884.
• Klapoetke S. a kol. J Pharm Biomed Anal. 2010;53(3):315–324.
• Cook K.S. a kol. Biologicals. 2012;40(2):109–117.
• Cohen S.A. a kol. Anal Biochem. 1993;211(2):279–287.
• Cohen S.A. a kol. Techn Protein Chem IV. 1993:289–298.
• Ivleva V. a kol. Waters Appl. Note. 2012;720004212.
• Kung L.A. a kol. Mol Syst Biol. 2009;5:308.
• Schwalbe R.A. a kol. J Biol Chem. 1996;271(39):24201–24206.
• Lauber M.A. a kol. Waters Appl. Note. 2013;720004717EN.
• Yu Y.Q. a kol. Waters Appl. Note. 2007;720001146EN.
• Yu Y.Q. a kol. Rapid Commun Mass Spectrom. 2005;19(16):2331–2336.
• Lauber M.A. a kol. Waters Tech Brief. 2014;720005116EN.