RAPID PREPARATION OF RELEASED N-GLYCANS FOR HILIC ANALYSIS USING A NOVEL FLUORESCENCE AND MS-ACTIVE LABELING REAGENT

Význam tématu

Analýza uvolněných N-glykanů je nezbytná v biotechnologii, farmaceutickém vývoji a proteomice, protože glykosylace ovlivňuje funkci, stabilitu a imunogenicitu glykoproteinů. Moderní metody založené na HILIC chromatografii s fluorescenční a hmotnostní detekcí vyžadují rychlé, citlivé a reprodukovatelné vzorkové přípravy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlý, jednoduchý a vysoce citlivý postup označování uvolněných N-glykanů kombinující výhody fluorescenční a MS detekce. Představen byl nový derivatizační činidlo RapiFluor-MS, které umožňuje:

• označení glykosylaminů během 5 minut pod mírnými vodnými podmínkami,
• vznik stabilního uretanova vazby zajišťujícího vysokou kvantovou výtěžnost fluorescence,
• znatelně zlepšenou ionizační účinnost v ESI-MS.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorková příprava zahrnovala tři kroky: deglycosylaci, označení a čistění SPE. K deglycosylaci byla použita Rapid PNGase F společně s surfaktantem RapiGest SF, po 2min thermálním denaturaci a 5min enzymatické reakci při 50 °C. Označení proběhlo nástřikem RapiFluor-MS činidla, které se vázalo na glykosylaminy. Čištění vzorku provedla HILIC µElution SPE s aminopropyl silikou, následoval přímý nástřik do LC-FLR-MS.

Instrumentace:

• UHPLC systém: Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio
• Kolona: ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide 130Å 1.7 µm, 2.1×50 mm
• Fluorescenční detekce: Ex 265 nm/Em 425 nm (RapiFluor-MS)
• MS: Waters Synapt G2-S HDMS, ESI+, TOF MS

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání RapiFluor-MS s komerčními činidly Instant AB a 2-AB ukázalo výrazné zlepšení citlivosti:

• 2× vyšší fluorescenční signál pro typický biantennární FA2 glykosid
• 780× vyšší MS signál ve srovnání s Instant AB

RapiFluor-MS umožnil plně kvantitativní uvolnění a značící reakci za méně než 30 min, včetně rychlé deglycosylace a SPE čistění bez sušení vzorku. SPE krok zachoval poměry jednotlivých glykanů při jedné i dvou průchodech.

Přínosy a praktické využití metody

Nový protokol přináší:

• rychlou přípravu vzorku z glykoproteinu do analýzy do 30 min
• skokové zvýšení citlivosti pro fluorescenční i MS detekci
• snížení pracovního zatížení a rizika ztrát vzorku
• schopnost přesného profilování glykosidů od neutrálních po tetrasialylované

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj derivatizačních reagentů s rozšířeným spektrem fluoroforů a optimalizací pro nové ionizační techniky. Integrace automatizovaných pracovních postupů a přímé adaptace na high-throughput platformy zajistí širší nasazení v klinické glykomice, QC biopharmaceutik a vývoji biosimilars.

Závěr

RapiFluor-MS představuje kompletní řešení pro rychlou, vysoce citlivou a reprodukovatelnou analýzu uvolněných N-glykanů metodou HILIC-FLR-MS, které kombinuje zjednodušenou přípravu vzorku s vynikající výkonností detekce.

Reference

• 1. Mechref Y.; Hu Y.; Desantos-Garcia J. L.; Hussein A.; Tang H. Quantitative glycomics strategies. Mol. Cell Proteomics 2013, 12(4), 874–884.
• 2. Cook K. S.; Bullock K.; Sullivan T. Development and qualification of an antibody rapid deglycosylation method. Biologicals 2012, 40(2), 109–117.
• 3. Klapoetke S.; Zhang J.; Becht S.; Gu X.; Ding X. The evaluation of a novel approach for profiling and identification of N-linked glycans with a procainamide tag by HPLC with fluorescent and mass spectrometric detection. J. Pharm. Biomed. Anal. 2010, 53(3), 315–324.