Extraction of Testosterone from Serum using Oasis Max μElution Plates for Clinical Research

Význam tématu

Testosteron je klíčový steroidní hormon indikující funkci endokrinního systému a je často sledován v klinických studiích pro hodnocení farmakokinetiky a bioavailability. Analýza jeho nízkých fyziologických koncentrací v séru vyžaduje vysoce citlivé a selektivní metody.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat vysoce selektivní techniku extrakce pevnou fází (SPE) s využitím destiček Oasis MAX µElution pro izolaci testosteronu ze séra a jeho kvantifikaci metodou LC-MS/MS. Postup byl porovnán s Oasis HLB µElution a proteinovou precipitací.

Použitá metodika

Vzorky séra byly fortifikovány interním standardem (testosteron-13C3), amoniakem, síranem zinečnatým, methanolem a vodou. Po odstředění byl supernatant aplikován na Oasis MAX µElution destičku s předchozí kondicionací a ekvilibrací. Následovalo promytí vysokým pH (amoniak v 20 % methanolu) a eluce methanolem a vodou. Do LC-MS/MS systému ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD bylo injikováno 20 µl eluátu. Chromatografické oddělení proběhlo na kolonce HSS C18 SB s mobilní fází 2 mM acetátu amonného a 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě a methanolu. Použité MRM přechody byly 289,2→96,9 (kvantifikátor) a 289,2→109,0 (kvalifikátor).

Použitá instrumentace

• Oasis MAX µElution Plate (PN 186001829)
• ACQUITY UPLC I-Class
• Xevo TQD
• ACQUITY UPLC HSS C18 SB Column (PN 186004118)

Hlavní výsledky a diskuse

Oasis MAX µElution destička poskytla nejvyšší poměr signál/šum, téměř trojnásobně lepší než Oasis HLB a proteinová precipitace. Dále účinně odstranila interferenční složky v MRM trace jak kvantifikátoru, tak kvalifikátoru. Metoda byla validována v rozsahu 0,17–51 nmol/l s celkovou precizností ≤5,0 % RSD a opakovatelností ≤3,1 % RSD.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší selektivita SPE vedoucí k výraznému zlepšení S/N
• Citlivé stanovení nízkých koncentrací testosteronu (LLOQ 0,17 nmol/l)
• Vynikající reprodukovatelnost a preciznost (≤5 % RSD)

Budoucí trendy a možnosti využití

Kombinace pokročilého SPE a LC-MS/MS lze rozšířit pro další steroidní analyty a multiplexní aplikace. Očekává se nárůst automatizace a miniaturizace destiček, integrace s vysokým rozlišením či hyphenovanými technikami. Metoda má potenciál pro toxikologii, dopingové kontroly a personalizovanou medicínu.

Závěr

Navržená metoda spojující Oasis MAX µElution SPE a LC-MS/MS přináší vysoce selektivní, citlivou a reprodukovatelnou analýzu testosteronu v séru pro klinický výzkum.

Reference

• Miller J et al. Pharmacokinetics and Relative Bioavailability of Absorbed Testosterone After Administration of a 1.62% Testosterone Gel to Different Application Sites in Men With Hypogonadism. Endocr Pract. 2011 Jul-Aug;17(4):574-583. doi:10.4158/EP10192.OR.