Structural Analysis of an O-Glycopeptide Derived from Recombinant Erythropoiet in by SYNAPT High Definit ion Mass Spectrometry (HDMS)

Význam tématu

Analýza glykozylace terapeutických proteinů je klíčová pro pochopení jejich biologické aktivity, stability, imunogenicity a zajištění shody s regulačními požadavky. O-glykosylace je obzvláště náročná kvůli variabilitě řetězců a nedostatku consensus sekvence.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ukázat, že kombinace iontové mobility (IMS) a vysoce výkonné tandemové hmotnostní spektrometrie (HDMS) se strategií TAP fragmentace umožňuje v jediné analýze určit strukturu O-glykanu i místo jeho napojení na peptid. Systém SYNAPT HDMS využívá Triwave technologii pro paralelní a časově zarovnanou fragmentaci.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: rekombinantní erytropoetin z CHO buněk, redukce DTT, alkylace IAA, trypsinový digest.

LC podmínky:

• Systém nanoACQUITY UPLC, kolona Atlantis dC18 (300 µm×100 mm, 3 µm)
• Teplota kolony 40 °C, průtok 5 µL/min
• Gradient 1–50 % ACN/0,1 % FA za 30 min

MS podmínky:

• Systém Waters SYNAPT HDMS, ESI pozitivní režim
• Triwave™: TRAP T-Wave CE 30–50 V pro glykanovou fragmentaci
• IMS T-Wave (N₂, tlak 0,5 mbar) pro separaci fragmentů podle mobility
• TRANSFER T-Wave s pulsním střídáním CE 5 V (nízká energie) a 60–100 V (vysoká energie) pro druhou fázi fragmentace

Hlavní výsledky a diskuse

Pomocí nízkoenergetické fáze TAP fragmentace byly izolovány fragmenty glykanského řetězce (NeuNAc-Hex-HexNAc). Iontová mobilita umožnila oddělení produktů první fáze. Zvýšením energie ve druhé fázi fragmentace se identifikovaly peptidové fragmenty, což potvrdilo lokalizaci O-glykany na serin v pozici 6 (v sekvenci EAISPPDAASAAPLR).

Přínosy a praktické využití metody

• Jednorázové získání informací o glykanu i glykosylačním místě
• Vyšší citlivost a specifičnost ve srovnání s konvenčními MS/MS
• Význam pro kontrolu kvality, regulaci výrobních šarží a hodnocení imunogenicity léčiv

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a zpracování dat v rámci glykoproteomických studií
• Rozšíření přístupu na další typy glykoproteinů a komplexnější glykomické analýzy
• Integrace s bioinformatickými nástroji pro rychlou anotaci glykoform
• Vývoj pokročilejších iontově-mobilních separací pro jemnější oddělení isomerů

Závěr

Strategie TAP fragmentace na SYNAPT HDMS představuje silný nástroj pro detailní, site-specifickou charakterizaci O-glykosylovaných peptidů. Umožňuje zefektivnit analýzu glykosylace v jediné experimentální sekvenci, což podporuje vývoj a kontrolu léčiv.

Reference

1. Medzihradszky KF. Methods Enzymol. 405, 116–138 (2005).
2. U.S. Patent 5,206,506 (1993).
3. Sasaki H., Ochi N., Dell A., Fukuda M. Biochemistry 27, 8618–8626 (1988).