Comprehending COVID-19: Structural Characterization of the Glycan Assemblies of O-linked Glycopeptides Using Cyclic Ion Mobility

Význam tématu

Charakterizace glykanových struktur na O-vázaných glykoproteinech koronaviru SARS-CoV-2 je klíčová pro pochopení mechanismu vstupu viru do buněk a pro vývoj vakcín či imunoterapií. Glykosylace spike proteinu ovlivňuje jeho proteolytické štěpení, sterickou ochranu před imunitními protilátkami i afinitu k hostitelským receptorům.

Cíle a přehled studie

Štúdie se zaměřuje na detailní strukturální analýzu O-vázaných glykanů v blízkosti furinového štěpného místa spike proteinu. Cílem je stanovit typy glykanových jader (core 1, extended core 1, core 2) a vazebné polohy kyseliny sialové (α2-3 a α2-6) za použití cyklické iontové mobility s vysokým rozlišením.

Použitá metodika a instrumentace

Proteomický workflow zahrnoval redukci a alkylaci disulfidických můstků, odbourání N-glykanů PNGasaF a trypsinovou digesci.

• Chromatografie: nanoUPLC (ACQUITY UPLC M-Class)
• Kolony: nanoEase M/Z HSS T3 100 Å (1.8 µm, 75×150 mm) a Symmetry C18 100 Å (5 µm, trap 180×20 mm)
• Teploty: kolona 60 °C, vzorek 8 °C, průtok 500 nL/min
• Mobilní fáze: voda/ACN s 0,1 % kyseliny mravenčí a 1 ppm kyseliny citronové
• MS: SELECT SERIES Cyclic IMS (ESI+; m/z 50–2000; kolizní energie 30–70 V; pět průchodů iontové mobility; IMS cyklus 100 ms)
• Software: MassLynx, DriftScope, Embedded Analyzer

Hlavní výsledky a diskuse

Pomocí cílené CID cIM-MS analýzy glycopeptidu T56 bylo zjištěno:

• Oddělení isomerů oxoniových iontů HexNAc–Hex–NeuAc při jedné a pěti průchodech IMS.
• Dva hlavní trimery m/z 657 s rozdílnými kolizními průřezy (234,1 Å2; 245,4 Å2) odpovídají vazbám NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc a NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc.
• Při pěti průchodech IMS byla další diferenciace na tři subpopulace, jež potvrzují přítomnost extended core 1 a core 2 struktur.
• Glykopeptidy s jedním NeuAc vykazují jednu izomerní formu odpovídající core 1; s dvěma NeuAc se objevují další izomery s vazbou na GalNAc.

Přínosy a praktické využití metody

Cyklická iontová mobilita v kombinaci s vysoce citlivou MS/MS umožňuje:

• Site-specifickou a linkage-specifickou charakterizaci nízkoabundantních O-glykopeptidů.
• Rozlišení izomerických glykanů, které nelze jednoznačně analyzovat běžnou LC-MS.
• Získání detailních dat pro vývoj vakcín a terapeutik ovlivňujících glykanovou povrchovou masku viru.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směry zahrnují:

• Integraci IMS s dalšími typy fragmentačních technik pro komplexní mapování glykosylací.
• Využití strojového učení pro predikci IMS dat a automatizovanou identifikaci glykoizomerů.
• Rozšíření analýzy na celou povrchovou glykoproteomiku SARS-CoV-2 a jiných patogenů.

Závěr

SELECT SERIES Cyclic IMS poskytuje vysoké rozlišení a selektivitu pro studium O-vázaných glykánů na spike proteinu SARS-CoV-2, což přispívá k hloubkovému pochopení virové biologie a k podpoře vývoje nových antivirových strategií.

Reference

1. Johns Hopkins University. COVID-19 Case Tracker. 2020.
2. Andersen KG et al. The proximal origin of SARS-CoV-2. Nat Med. 2020;26:450–452.
3. Tortorici AM, Veesler D. Structural insights into coronavirus entry. Adv Virus Res. 2019;105:93–116.
4. Walls AC et al. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell. 2020;181(2):281–292.e6.
5. Clark GF. The Role of Glycans in Immune Evasion. Mol Hum Reprod. 2014;20(3):185–199.
6. Chang D, Zaia J. Why Glycosylation Matters in Building a Better Flu Vaccine. Mol Cell Proteomics. 2019;18(12):2348–2358.
7. Khatri K et al. Integrated Omics Reveal Basis for Influenza A Virus Glycan Microheterogeneity. Mol Cell Proteomics. 2016;15(6):1895–1912.
8. Kumar S et al. Structural, Glycosylation and Antigenic Variation between 2019-nCoV and SARS-CoV. Virusdisease. 2020;31(1):13–21.
9. Watanabe Y et al. Site-Specific Glycan Analysis of the SARS-CoV-2 Spike. Science. 2020;eabb9983.
10. Shajahan A et al. Deducing the N- and O- Glycosylation Profile of the Spike Protein of SARS-CoV-2. Glycobiology. 2020;cwaa042.
11. Sanda M, Morrison L, Goldman R. N- and O- Glycosylation of the SARS-CoV-2 Spike Protein. bioRxiv. 2020.07.05.187344.
12. Zhang Y et al. Site-specific N-glycosylation Characterization of Recombinant SARS-CoV-2 Spike Proteins. Mol Cell Proteomics. 2020; mcp.RA120.002295.
13. Zhou D et al. Identification of 22 N-Glycosites on Spike Glycoprotein of SARS-CoV-2. Glycobiology. 2020;cwaa052.
14. Hoffmann M et al. A Multibasic Cleavage Site in the Spike Protein of SARS-CoV-2 Is Essential for Infection. Mol Cell. 2020;78(4):779–784.
15. Xia S et al. The Role of Furin Cleavage Site in SARS-CoV-2 Spike Protein-Mediated Membrane Fusion. Signal Transduct Target Ther. 2020;5:92.
16. Guttman M, Lee KK. Site-Specific Mapping of Sialic Acid Linkage Isomers by Ion Mobility Spectrometry. Anal Chem. 2016;88(10):5212–5217.
17. Depland AD et al. Identification of Sialic Acid Linkage Isomers in Glycans using IRMPD MS. Int J Mass Spectrom. 2018;434:64–69.