Clone Selection Using the Agilent 1290 Infinity Online 2D-LC/MS Solution

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) jsou klíčovou třídou biologických léčiv využívaných v onkologii a imunitních onemocněních. Efektivní výběr klonů s vysokou expresí a požadovanou kvalitou je zásadní pro vývoj terapeutik a biosimilár. Online 2D-LC/MS přináší možnost integrovat obohacení protilátky a potvrzení její integrity a modifikací v jediném běhu, čímž šetří čas, materiál a minimalizuje chyby spojené s offline přípravou.

Cíle a přehled studie

Tento Application Note popisuje řešení Agilent 1290 Infinity online 2D-LC/MS pro selekci klonů a kvantifikaci rituximabu. První dimenze využívá afinitní Protein A kolonu pro obohacení mAb, druhá dimenze systém RP-mAb diphenyl pro odsolení a následnou analýzu na Accurate Mass Q-TOF MS. Studie demonstruje princip proof of principle na páru originálu a biosimiláru rituximabu ve vzorku DMEM.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity 2D-LC se dvěma G1170A pohony ventilů a 40µl heart-cut smyčkami (G4242)
• Agilent 1260 Infinity Bio-Inert Quaternary Pump (G5611A) a 1290 Infinity Binary Pump (G4220A)
• Agilent 1260 Infinity Autosampler s termostatem (G4226A, G1330B)
• Agilent 1260 Infinity Diode Array Detektory (G1315C)
• Agilent 6530 Accurate Mass Q-TOF LC/MS (G6530A)
• Software: OpenLab CDS ChemStation C.01.07, MassHunter Workstation B.06.01, BioConfirm B.07
• Kolony: Bio-Monolith Protein A 4.6×12.5 mm a AdvanceBio RP-mAb Diphenyl 2.1×50 mm

Použitá metodika

Vzorky rituximabu naředěné v DMEM byly odstředěny pro odstranění částic. V první dimenzi proběhla afinitní purifikace na Protein A kolonu za gradientu PBS a acetic acid. Vybrané frakce (heart-cuts) byly automaticky přesměrovány do smyček pro druhou dimenzi. Druhá dimenze využívala reverzní chromatografii na RP-mAb diphenyl kolonu s gradientem izopropanolu, acetonitrilu a kyseliny mravenčí. Eluát byl přiváděn do Q-TOF MS pro detailní hmotnostní analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace afinitní dimenze zajišťuje účinné obohacení mAb z DMEM. Kalibrační křivka pro rituximab ukázala v rozsahu 0,2–10 µg/µl vynikající linearitu (R²=0,9996) s návratností 98–103 %. MS analýza poskytla dekonvoluci hmotnostních spekter, odhalila glykofory protilátek a umožnila odlišení inovátoru od biosimiláru. Mirror ploty zdůraznily dodatečné modifikace biosimiláru.

Přínosy a praktické využití metody

Integrované 2D-LC/MS řešení zkracuje dobu analýzy, redukuje manipulaci se vzorky a zvyšuje reprodukovatelnost. Metoda podporuje rychlé porovnání inovátorů a biosimilár, přesnou kvantifikaci mAb a detekci strukturálních variací, což usnadňuje výběr klonů ve vývojových a výrobních procesech.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj bude směřovat k rychlejším desaltovacím patronám, rozšíření na různé třídy protilátek, automatizaci heart-cut konfigurací a integraci s glykoprofilingem či dalšími hyphenovanými technikami pro komplexní charakterizaci mAb.

Závěr

Prokázaný online 2D-LC/MS přístup s afinitní purifikací a reverzní chromatografií představuje efektivní nástroj pro selekci klonů, kvantifikaci a detailní charakterizaci monoklonálních protilátek. Integrace do workflow vývoje inovátorů a biosimilár usnadní rychlá rozhodnutí a zlepší kvalitu výsledných produktů.

Reference

• Scott AM, Wolchok JD, Old LJ. Antibody Therapy of Cancer. Nature Reviews Cancer. 2002;12:278–287.
• Udpa N, Million RP. Monoclonal antibody biosimilars. Nature Reviews Drug Discovery. 2016;15:13–14.
• Dumont E, et al. Cell Clone Selection Using the Agilent Bio-Monolith Protein A Column and LC/MS. Agilent Technologies Application Note. 2014;5991-5124EN.
• Suresh Babu CV. LC/MS of Intact Therapeutic Monoclonal Antibodies Using Agilent AdvanceBio RP-mAb. Agilent Technologies Application Note. 2015;5991-6296EN.
• Suresh Babu CV, Gudihal R. Agilent AdvanceBio Desalting-RP Cartridges for Online Desalting in 2D-LC/MS mAb Analysis. Agilent Technologies Application Note. 2016;5991-7066EN.
• Schneider S. 2D-LC/MS Characterization of Charge Variants Using Ion Exchange and Reversed-Phase Chromatography. Agilent Technologies Application Note. 2016;5991-6673EN.
• Suresh Babu CV. Charge Heterogeneity Analysis of Rituximab Innovator and Biosimilar mAbs. Agilent Technologies Application Note. 2015;5991-5557EN.