Analysis of Phosphatidylethanol (PEth) in Whole Blood using SPE and UPLC-MS/MS for Forensic Toxicology

Význam tématu

Phosphatidylethanol (PEth) je přímý biomarker konzumace alkoholu s výjimečnou specificitou a dlouhým oknem detekce až 3–4 týdny. Rozvoj spolehlivých metod pro stanovení PEth v krvi je zásadní v forenzní toxikologii pro rozlišení různých vzorců pití.

Cíle a přehled studie / článku

Tato práce představuje rychlou, čistou a robustní metodu extrakce a kvantifikace dvou nejběžnějších homologů PEth (16:0/18:1 a 16:0/18:2) z celkové krve. Kombinace pasážní SPE s ultra výkonnou UPLC-MS/MS analýzou zajistila citlivost až 10 ng/mL.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: 100 μL plné krve s interním standardem PEth 16:0/18:1-D5
• Proteinová precipitace: isopropanol a acetonitril s formiovou kyselinou
• SPE: Ostro Pass-Through Sample Preparation desky, dvoustupňové spuštění vzorku a eluce 60:20:20 ACN:IPA:voda
• Chromatografie: ACQUITY UPLC I-Class PLUS, kolona BEH C8 2.1×50 mm, 1.7 μm, 40 °C
• Mobilní fáze: A 5 mM amonium formiát s 0.1 % formiovou kyselinou; B 50:50 acetonitril:isopropanol; gradient 50:50→100 % B za 3 min
• Detekce: Xevo TQ-S micro v negativním režimu ESI, dva přechody pro každý analyzát
• Kvantifikace: kalibrace 10–1000 ng/mL, validace pro linearitu, přesnost, precizi, citlivost, stabilitu a carryover

Hlavní výsledky a diskuse

• Extrakční výtěžnost: 88 % pro PEth 16:0/18:2 a 79 % pro PEth 16:0/18:1, RSD < 10 %
• Matrix efekt: < 13 %, minimální potlačení signálu
• Retence a separace: retenční časy 2.54 min (16:0/18:2) a 2.64 min (16:0/18:1), nulový carryover díky silnému elučnímu gradientu a rychlému „sawtooth“ přerušení
• Lineární rozsah 10–1000 ng/mL s korelačními koeficienty blízko 1
• Mez kvantifikace 10 ng/mL, přesnost v rámci 15 % a precize RSD 5.1 %

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje rychlou a jednoduchou přípravu vzorku s vysokou čistotou extraktu a výbornou citlivostí. Je ideální pro forenzní toxikologii, klinická vyšetření a monitorování různých vzorců pití od mírné až po silnou konzumaci alkoholu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření o další homology PEth pro komplexnější profil biomarkerů
• Automatizace přípravy vzorku a vysokoprůtokové platformy pro zvýšení kapacity laboratoře
• Integrace s novými typy hmotnostních analyzátorů pro vyšší selektivitu a citlivost
• Aplikace v epidemiologických studiích a personalizované medicíně

Závěr

Vyvinutá metoda spojuje efektivní pasážní SPE s rychlou UPLC-MS/MS analýzou a splňuje požadavky na přesnost, precizi a citlivost při kvantifikaci PEth v krvi. Metoda je vhodná pro rutinní forenzní a klinické aplikace.

Reference

1. Helander N. et al. Molecular Species of the Alcohol Biomarker Phosphatidylethanol in Human Blood Measured by LC-MS. Clin Chem. 2009;55(7):1395–1405.
2. Andreassen T. et al. High Throughput UPLC-MS/MS Method for the Analysis of Phosphatidylethanol (PEth) 16:0/18:1 in Whole Blood. J Anal Tox. 2018;42(1):33–41.
3. Kechegias S. et al. Phosphatidylethanol Compared with Other Blood Tests as A Biomarker of Moderate Alcohol Consumption. Alcohol Alcoholism. 2015;50(4):399–406.
4. Stewart SH. et al. Phosphatidylethanol and Alcohol Consumption in Reproductive Age Women. Alcohol Clin Exp Res. 2010;34(3):488–492.
5. Ohuou P. et al. UPLC-MS/MS Method for Quantitation of EtG and EtS in Human Urine. Waters Customer Communication. 2018;720006273EN.