Lipids analysis by 2 dimensional LC coupled with triple quadrupole mass spectrometer

Význam tématu

Glycerofosfolipidy tvoří základní stavební kameny buněčných membrán a zprostředkovávají klíčové biologické procesy včetně signalizace a transportu látek. Přesná identifikace a kvantifikace minoritních lipidů je zásadní pro pochopení metabolických drah a diagnostiku onemocnění.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout vysoce selektivní a citlivou metodu pro analýzu glycerofosfolipidů pomocí dvoudimenzionální kapalinové chromatografie spojené s triplekvadrupólovým hmotnostním spektrometrem (2D LC–MS/MS). Metoda měla odstranit rušivé matricové efekty a umožnit spolehlivou kvantifikaci několika tříd lipidů.

Použitá instrumentace

• Shim-pack XR-SIL (100 × 3,0 mm, 2,2 µm) pro NP-HPLC první dimenze
• COSMOSIL HILIC guard kolona (10 × 4,6 mm, 5 µm) pro zachytávání frakcí
• L-column2 ODS (100 × 1,5 mm, 3 µm) pro RP-HPLC druhé dimenze
• Shimadzu LCMS-8040 s ESI v režimu MRM

Použitá metodika

Metoda kombinovala tři průtokové dráhy: první dimenze v normálním fázi pro třídní separaci, zachytávací kolonu pro koncentraci cílových lipidů a druhou dimenzi v obrácené fázi pro detailní rozlišení jednotlivých molekul. Mobilní fáze byly optimalizovány pro každou kolonu a systém automaticky přepínal ventily pro frakcionaci a přenos.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vynikající linearitu kalibračních křivek (r2 ≥ 0,997) a reprodukovatelnost (RSD < 9 %). Dvoudimenzionální přístup výrazně eliminoval potlačení i zesílení signálu způsobené matricovými složkami, které se projevovaly u konvenční RP-HPLC. U vzorků s různým poměrem matric směsí byla přesnost kvantifikace u 2D LC blízko 100 %, zatímco u jednorozměrné metody se odchylky pohybovaly v rozsahu 60–140 %.

Přínosy a praktické využití metody

Dvoustupňová chromatografie s MRM detekcí umožňuje:

• selektivní koncentraci cílových tříd lipidů
• minimalizaci rušivých matricových efektů
• spolehlivou detekci a kvantifikaci minoritních lipidů v komplexních vzorcích

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat adaptaci na různé třídy lipidů, automatizovanou výměnu kolen a mobilních fází, integraci s vysoce rozlišenými spektrometry a rozšíření aplikací do klinické lipidomiky, farmakologie či potravinářské analýzy.

Závěr

Vyvinutá 2D LC–MS/MS metoda poskytuje robustní a vysoce citlivý nástroj pro analýzu glycerofosfolipidů, který překonává klasické RP-HPLC omezení a umožňuje věrohodné kvantitativní výsledky i v přítomnosti složitých matric.

Reference

NEDO projekt "Fundamental Technology for Promoting Industrial Application of Human Stem Cells", New Energy and Industrial Technology Development Organization, 2013.