Identification of triazolam, etizolam and their metabolites in biological samples by liquid chromatography tandem mass spectrometry

Význam tématu

Analýza benzodiazepinů a jejich metabolitů v biologických vzorcích je klíčová jak v klinické praxi, tak ve forenzní toxikologii. Triazolam a etizolam se široce užívají pro své sedativní a anxiolytické účinky, přičemž jejich metabolity mohou ovlivnit farmakokinetiku a interpretaci výsledků. Spolehlivá metoda pro simultánní detekci těchto látek zlepšuje diagnostiku, sledování terapií a vyšetřování případů zneužití.

Cíle a přehled studie

Vyvinout a validovat vysoce selektivní a citlivou analytickou metodu založenou na UHPLC separaci a tandemové hmotnostní spektrometrii (LC-MS/MS) pro současné stanovení triazolamu, etizolamu a čtyř hlavních metabolitů v biologických matricích. Metoda měla zajistit vysoké rozlišení, rychlou analýzu a možnost automatického spouštění MS/MS v režimu MRM.

Použitá metodika a instrumentace

In vitro metabolismus:

• Incubace triazolamu a etizolamu s lidským jaterním S9 frakcí za přítomnosti regenerace NADPH (NADP+, glukóza-6-fosfát, G6PD). Teplota 37 °C, ~17 h.
• Kontrolní vzorek bez přídavku látek.

Extrakce SPE:

1. Podmínění C18 kolony MeOH (2 mL).
2. Equilibrace 0,1% kyseliny octové (2 mL).
3. Naložení vzorku (250 µL).
4. Eluce MeOH (1 mL), vysušení a rekonstituce v 500 µL vody.

UHPLC podmínky:

• Systém: Shimadzu Nexera UHPLC.
• Kolona: YMC-Triart C18, 1,9 µm, 150×2 mm.
• Fáze A: 10 mM kyselina mravenčí; fáze B: 10 mM kyselina mravenčí/acetonitril (1:1).
• Gradient: B od 40 % → 65 % (0–40 min) → 40 % (40,01–60 min), průtok 0,3 mL/min, T 40 °C.
• Injekce 1 µL.

MS/MS podmínky:

• Hmotnostní spektrometr: Shimadzu LCMS-8030, ESI pozitivní ionizace.
• Režim multiple reaction monitoring (MRM) s automatickým spouštěním MS/MS při překročení prahové intenzity.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila separaci a detekci sedmi sloučenin (triazolam, etizolam a pět metabolitů) na jedné chromatografické kolóně. Vzorek A bez matice prokázal dobré rozlišení všech sloučenin. Vzorek C (prázdná matrice S9) neobsahoval rušivé signály, což potvrzuje selektivitu. Ve vzorku B po in vitro metabolismu se objevily tři dodatečné píky: dva byly identifikovány jako 8-ethylhydroxyetizolam a α-hydroxyetizolam, třetí zatím nebyl jednoznačně určen. MS/MS spektra získaná metodou MRM triggered poskytla shodu s hypotetickou knihovnou a umožnila potvrzení známých metabolitů.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá LC-MS/MS metoda:

• Poskytuje vysokou selektivitu a citlivost při detekci benzodiazepinů a metabolitů v biologických vzorcích.
• Umožňuje zkrácení doby analýzy díky optimalizovanému chromatografickému gradientu.
• Automatické spouštění MS/MS zjednodušuje screening a potvrzování analytů.

Tato přístupnost je cenná pro klinické laboratoře, forenzní analýzy a kontrolu léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody o další nové benzodiazepiny a jejich metabolity včetně nevědecky užívaných derivátů.
• Implementace vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie (HRMS) pro exact mass screening.
• Miniaturizace přípravy vzorků (micro-SPE) a zkrácení doby analýzy pomocí Core-Shell a UHPLC kolón.
• Automatizace zpracování dat a využití umělé inteligence pro rychlé vyhodnocení MRM spekter.

Závěr

Použití UHPLC se sub-2 µm částicemi spolu s LCMS-8030 v MRM triggered režimu umožnilo vysoce selektivní a citlivou simultánní analýzu triazolamu, etizolamu a jejich metabolitů v biologických vzorcích. Metoda je vhodná pro rutinní klinické, forenzní a toxikologické aplikace.

Reference

• Shoji N., Minohata T., Kuriyama N., Yokoyama C., Matsumoto K., Watanabe J., Iida J. Identification of triazolam, etizolam and their metabolites in biological samples by LC-MS/MS. ASMS 2012, WP28-611.