Analysis of Choline and Acetylcholine in Rat Cerebrospinal Fluid Samples Using the Nexera UC-MS/MS System

Analýza cholinu a acetylcholinu v mozkomíšním moku potkanů pomocí SFC-MS/MS

Význam tématu

Cholin a acetylcholin hrají klíčovou roli v buněčné membráně a neurotransmisi. Jejich stanovení v mozkomíšním moku umožňuje sledovat nervovou činnost a vyhodnocovat farmakokinetické i patologické stavy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat metodu superkritické fluidní chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií (SFC-MS/MS) pro přímou analýzu cholinu a acetylcholinu v malých objemech mozkomíšního moku potkanů. Současně byl implementován online systém pro extrakci pomocí superkritické fluidy (SFE) a vzorkování na filtrační papír pro usnadněné skladování a transport.

Použitá metodika a instrumentace

• Systém: Nexera UC SFC-MS/MS (LCMS-8050, ESI, režim MRM)
• Kolona: Inertsil CN-3 (250 × 4,6 mm, 5 μm)
• Mobilní fáze: superkritické CO2 + methanol s 20 mmol/l ammonium formiátem (95/5, v/v)
• Teplota kolony: 40 °C; tlak BPR: 10 MPa; teplota BPR: 50 °C; průtok: 2,5 ml/min; injekční objem: 1 μl
• Online SFE: vzorek na filtračním papíru (0,2 ml nádobka), extrakční teplota 60 °C, staticko-dynamický cyklus

Hlavní výsledky a diskuse

• Linearita: r2 = 0,9993 pro cholin, r2 = 0,9982 pro acetylcholin při 10–1000 μg/l
• LOQ: 30 μg/l pro cholin, 10 μg/l pro acetylcholin
• Opakovatelnost: RSD ret. času < 0,1 %, RSD oblasti vrcholu 1,7–7,5 %
• V přímé injekci CSF byla cholin kvantitativně stanoven (229,6 μg/l), acetylcholin pod LOQ, identifikován jen přítomnost
• Online SFE-SFC-MS/MS zvýšilo poměr S/N, umožnilo kvantifikovat acetylcholin (1,7 μg/l) a dosáhlo shodného stanovení cholinu (297 μg/l)

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé a citlivé stanovení neurotransmiterů v mikroobjemech biologických vzorků. Online extrakce na filtrační papír zjednodušuje manipulaci, zlepšuje stabilitu vzorku a minimalizuje maticové efekty.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další biogenní aminy a jejich metabolity
• Miniaturizace a automatizace SFE-SFC-MS/MS pro klinické aplikace
• Integrace s in vivo mikrodyalýzou pro longitudinální studie
• Aplikace v preklinickém výzkumu a farmakoekologii

Závěr

Navržená SFC-MS/MS metoda s možností online extrakce pomocí SFE poskytuje robustní, reprodukovatelné a citlivé přístupy k analýze cholinu a acetylcholinu v mozkomíšním moku, což otevírá cestu pro pokročilé bioanalytické a preklinické studie.

Reference

• Watabe Y., Iida T. Application No. L519, Shimadzu Corporation, 2017