Analysis of Hydroxychloroquine and Metabolites in Human Serum and Plasma Using the Agilent Captiva EMR—Lipid by LC-QQQ

Význam tématu

Hydroxychlorochin (HCQ) a jeho aktivní metabolity jsou klíčové pro léčbu malárie, autoimunitních onemocnění i dalších indikací. Přesné stanovení koncentrací HCQ a jeho tří hlavních metabolitů (desethylchloroquine, desethylhydroxychloroquine, bisdesethylchloroquine) v lidské plazmě a séru je zásadní pro farmakokinetické studie, terapeutické monitorování a hodnocení bezpečnosti. Moderní LC-MS/MS metody poskytují vysokou citlivost a selektivitu, avšak vyžadují účinné odstranění proteinů a lipidů pro minimalizaci rušení měření.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a plně validovat robustní, selektivní a citlivou kvantitativní metodu pro simultánní analýzu HCQ a tří jeho metabolitů v lidské plazmě a séru. Vzorky o objemu 100 µl byly podrobeny precipitaci proteinů, následné účinné očistě pomocí sorbentu EMR-Lipid a následné analýze metodou LC-QQQ.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika vzorkové přípravy:

• Odebrání 100 µl séra nebo plazmy.
• Přidání 25 µl roztoku NH4OH a precipitace organickým rozpouštědlem (95/5 ACN/MeOH) s 5,8 % NH4OH.
• Využití Agilent Captiva EMR-Lipid 96-jamtkové destičky pro odstranění lipidů.
• Sušení eluátu pod vakuem a rekonstituce v 95/5 ACN/voda s 0,1 % FA.

Instrumentace:

• HPLC Agilent se ZORBAX Eclipse XDB-C8 kolonkou (2.1 × 50 mm, 3.5 µm).
• LC-QQQ Agilent (elektrospray pozitivní režim, MRM přechody).
• Agilent PPM-96 pozitivní tlakový manifold pro čištění 96-jamtkových destiček.
• Vortexer, shaker, centrifuga (15 000 rpm, 4 °C), CentriVap sušič.

Hlavní výsledky a diskuse

Dynamický rozsah metody byl 0,4–100 ng/ml se lineárními kalibračními křivkami (R2 > 0,99). Mez kvantifikace (LOQ) 0,4 ng/ml dosahovala S/N ≥10 a příspěvek matrix blank byl <20 % signálu analytem. Absolutní výtěžky analyzovaných sloučenin se pohybovaly mezi 60 a 120 % (RSD <15 %). Matrix effect ve většině případů překročil 50 %. Validace prokazuje přesnost (100 ± 15 %) a precizi (CV <15 %) na třech úrovních QC (1, 10, 100 ng/ml).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda vyžaduje pouze 100 µl vzorku, kombinuje vysokou propustnost a minimalizuje počet manipulačních kroků. Umožňuje spolehlivou podporu klinických farmakokinetických studií, terapeutického monitorování a QA/QC v laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na další léčivé látky a metabolity, implementovat multiplexní analýzy a automatizovat přípravu vzorků pomocí robotických platforem. Dále se otevírá prostor pro aplikaci na jiné biologické matrice a integraci do diagnostických workflow.

Závěr

Vyvinutá LC-QQQ metoda s EMR-Lipid čištěním nabízí rychlé, citlivé a robustní stanovení hydroxychlorochinu a jeho metabolitů v lidském séru a plazmě. Splňuje požadavky klinického výzkumu na linearitu, citlivost, selektivitu, přesnost i precizi.

Reference

1. Lim HS et al. Pharmacokinetics of Hydroxychloroquine and its Clinical Implications in Chemoprophylaxis Against Malaria Caused by Plasmodium Vivax. Antimicrob. Agents Chemother. 2009, 53, 1468–1475.
2. Wang LZ et al. Method Development and Validation for Rapid Quantification of Hydroxychloroquine in Human Blood Using LC-MS/MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 2012, 61, 86–92.
3. Füzéry AK et al. A Rapid and Reliable Method for Quantitation of Hydroxychloroquine in Serum Using Turbulent Flow LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta 2013, 421, 79–84.
4. Soichot M et al. Development, Validation and Clinical Application of an LC-MS/MS Method for Simultaneous Quantification of Hydroxychloroquine and Metabolites in Human Whole Blood. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 100, 131–137.
5. Zhao L, Juck M. Protein Precipitation for Biological Fluid Samples Using Agilent Captiva EMR-Lipid 96-Well Plates. Agilent Technologies 2018, app. note 5991-9222EN.
6. Zhao L, Lucas D. Quantitative LC/MS/MS Analysis of Drugs in Human Serum with Agilent Captiva EMR-Lipid Cleanup. Agilent Technologies 2017, app. note 5991-8007EN.
7. Lucas D, Zhao L. Vitamin D Metabolite Analysis in Biological Samples Using Agilent Captiva EMR-Lipid. Agilent Technologies 2017, app. note 5991-7956EN.
8. Larroque AL et al. Analysis of Hydroxychloroquine and Metabolites in Human Whole Blood Using the Agilent Captiva EMR-Lipid by LC/TQ. Agilent Technologies 2020, app. brief 5994-2420EN.
9. Warhurst DC et al. Hydroxychloroquine is Much Less Active Than Chloroquine Against Chloroquine-Resistant Plasmodium falciparum. J. Antimicrob. Chemother. 2003, 52(2), 188–193.
10. Chhonker YS et al. Simultaneous Quantitation of Hydroxychloroquine and its Metabolites in Mouse Blood and Tissues Using LC–ESI–MS/MS. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2018, 1072, 320–327.
11. Zhao L. Quantitative Determination of Drugs of Abuse in Human Whole Blood by LC/MS/MS Using Agilent Captiva EMR-Lipid Cleanup. Agilent Technologies 2018, app. note 5991-9251EN.
12. Charlier B et al. Development of a Novel Ion-Pairing HPLC-FL Method for Separation and Quantification of Hydroxychloroquine and its Metabolites in Whole Blood. Biomed. Chromatogr. 2018, 32(8), e4258.